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Das genetische Netzwerk der Gliedmaßenentwicklung

Analyse der dorso-ventralen Musterbildung in polydaktylen Mausmutanten

AutorLars Grotewold
VerlagVerlag für Wissenschaft und Forschung
Erscheinungsjahr2001
Seitenanzahl99 Seiten
ISBN9783897003095
FormatPDF
KopierschutzDRM
GerätePC/MAC/eReader/Tablet
Preis24,90 EUR
Die sich entwickelnden Gliedmaßen sind ein geeignetes Modellsystem zum Studium morphoregulatorischer Prozeße während der Embryogenese, da sie sowohl klassischen experimental-embryologischen als auch modernen molekularbiologischen Techniken zugänglich sind. Voraussetzung für die korrekte Musterbildung der Extremitäten ist die Kommunikation zwischen zwei Geweben, die durch sezernierte Signalmoleküle vermittelt wird. Durch die koordinierte Interaktion von sog. Signalzentren (Quellen der o.g. sezernierten Moleküle) wird das Muster entlang der drei Achsen einer Extremität festgelegt (z.B. die Anzahl und Identität der Finger einer Hand). Während der Entwicklung können mindestens drei Signalzentren in der Gliedmaßenknospe definiert werden, die Zone polarisierender Aktivität (ZPA), die im wesentlichen das Muster entlang der antero-posterioren Achse definiert, die apikale ektodermale Leiste (AER), die den distalen Auswuchs dirigiert und das distale Nicht-AER-Ektoderm, das entscheidend für die dorso-ventrale Asymmetrie ist. Die gegenseitigen Abhängigkeiten dieser Signalzentren erklären die Tatsache, daß die Fehlfunktion eines dieser Zentren zumeist Konsequenzen für mehr als eine Achse hat. In der vorliegenden Arbeit wird die Bedeutung der ZPA für die dorso-ventrale Musterbildung durch Genexpressionsstudien an Mausmutanten mit veränderter Anzahl der Finger untersucht.  

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Inhaltsverzeichnis
Abkürzungsverzeichnis8
Inhaltsverzeichnis12
1. Einleitung16
1.1 Allgemeines16
1.2 Gliedmaßenentwicklung19
1.2.1 Organisation der frühen Vertebratenextremität19
1.2.2 AER und PZ dirigieren den distalen Auswuchs20
1.2.3 Die ZPA vermittelt die antero-posteriore Musterbildung21
1.2.4 Etablierung der ZPA24
1.2.5 Dorso-ventrale Musterbildung und Wechselwirkungen zwischen den drei Signalzentren25
1.2.6 Positionierung der AER27
1.3 Die Mausmutanten Extra toes (Xt) und Hemimelic extra toes (Hx)29
1.4 Die Gene der Gli-Familie31
1.5 Zielsetzung35
2. Material und Methoden36
2.1 Chemikalien, Standardlösungen, Nährmedien36
2.2 Phenol-Chloroform-Extraktion und Ethanol-Fällung von DNA38
2.3 Sequenzspezifische Spaltung von DNA mit Restriktionsenzymen39
2.4 Agarosegelelektrophorese39
2.5 Isolierung von DNA-Fragmenten aus Agarosegelen40
2.6 Ligation von DNA-Fragmenten40
2.7 Transformation von Plasmiden in41
2.7.1 Herstellung kompetenter Zellen41
2.7.2 Transformation41
2.8 Präparation von Plasmid-DNA42
2.8.1 Plasmid-Mini-Präparation42
2.8.2 Plasmid-Maxi-Präparation42
2.9 Isolierung von genomischer DNA und RNA42
2.9.1 Isolierung von DNA aus extraembryonalen Membranen42
2.9.2 Isolierung von RNA aus ganzen Embryonen43
2.10 Konzentrationsbestimmung von Nukleinsäuren43
2.11 Polymerase-Ketten-Reaktion (PCR)44
2.11.1 Sequenzen der verwendeten Oligonukleotide44
2.11.2 PCR-Amplifikationen44
2.11.3 Reverse Transkription45
2.12 „Whole mount“ in situ Hybridisierung45
2.12.1 Lösungen45
2.12.2 Synthese der Antisense-RNA-Sonde46
2.12.3 Vorbehandlung und Hybridisierung47
2.12.4 Entfernung unspezifisch gebundener Sonde und Antikörperinkubation47
2.12.5 Entfernung unspezifisch gebundener Antikörper und Histochemie48
2.13 Doppel in situ Hybridisierung48
2.14 „Whole mount“ Immunohistochemie48
2.15 Histologische Techniken49
2.15.1 Paraffindünnschnitte49
2.15.2 Hämatoxylin/Eosin-Färbung50
2.16 Knochen-Knorpel-Färbung51
2.17 Fotodokumentation51
2.18 Tierexperimentelle Verfahren52
2.18.1 Tierhaltung52
2.18.2 Isolierung definierter Embryonalstadien52
2.18.3 Genotypisierung der Embryonen52
3. Ergebnisse54
3.1 Die Inversion der DV-Asymmetrie der anterioren Shh-Expressionsdomäne ist spezifisch für XtJ54
3.2 Expression dorsaler Markergene in XtJ/XtJ-Gliedmaßenknospen55
3.3 En-1-Expression in XtJ/XtJ-Gliedmaßenknospen59
3.4 Hoxc-13-Expression in XtJ/XtJ-Gliedmaßen60
3.5 XtJ/XtJ-Gliedmaßen zeigen keine morphologischen und histologischen Veränderungen des DV-Musters61
4. Diskussion63
4.1 Rolle von Shh für DV-Musterbildung63
4.2 DV-Musterbildung in XtJ/XtJ-Gliedmaßen65
4.3 Methodische Limitierungen67
4.4 Asymmetrische Shh-Expression68
4.5 Schlußfolgerung68
5. Zusammenfassung69
Literaturverzeichnis70

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