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Die Rolle des SV 40 17kDa Tumorantigens in der produktiven SV 40 Infektion und der SV 40-vermittelten Zelltransformation

Autor	Katja Scheidig
Verlag	Verlag für Wissenschaft und Forschung
Erscheinungsjahr	1999
Seitenanzahl	151 Seiten
ISBN	9783897000797
Format	PDF
Kopierschutz	DRM
Geräte	PC/MAC/eReader/Tablet
Preis	29,90 EUR

Das Simian Virus 40 (SV 40) dient seit langem als einfaches Modellsystem, um komplexe zelluläre Ereignisse zu erforschen. Von besonderer Bedeutung ist die Untersuchung der Meschanismen der Tumorentstehung (Zelluläre Transformation) und der Virusvermehrung (produktive Infektion). Die vielfältigen Funktionen, die SV40 in der Infektion und Transformation wahrnimmt, beruht auf der Expression regulatorischer Proteine (Tumorantigene), die von der frühen Region des Virusgenoms kodiert werden. Ei drittes frühes SV40 Protein, das SV40 17kDa Tumorantigen (17 kT), wurde 1993 isoliert. Die Charakterisierung von 17 kT sowie die Aufklärung seiner biologischen Funktionen ist das Thema dieser Untersuchung.

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Inhaltsverzeichnis

1 EINLEITUNG	12
1.1 Das Simian Virus 40 (SV40)	13
1.2 Vermehrungsszyklus des SV40 Virus	14
1.2.1 Produktive Infektion von SV40 permissiven Zellen	14
1.2.2 Nicht produktive, abortive Infektion von nicht permissiven Zellen	15
1.3 Struktur und Funktionen der viralen Tumorantigene	15
1.3.1 Das große SV40 Tumorantigen (T-Ag)	15
1.3.2 Das kleine SV40 Tumorantigen (t-Ag)	23
1.3.3 Das SV40 17kDa Tumorantigen	24
2 PROBLEMSTELLUNG	26
3 MATERIAL	29
3.1 Versuchstiere	29
3.2 Zellinien	29
3.2.1 Affennierenzellinien (SV40 permissiv)	29
3.2.2 Humane Zellinien (SV40 semipermissiv)	30
3.2.3 Rattenzellinien (SV40 nicht permissiv)	30
3.2.4 Mauszellinien (SV40 nicht permissiv)	31
3.2.5 Insektenzellen	31
3.2.6 Viren	31
3.2.7 Bakterienstämme	32
3.3 Antikörper	32
3.3.1 Monoklonale Antikörper, die gegen SV40 Tumorantigene gerichtet sind	32
3.3.2 Polyklonale Antikörper, die gegen SV40 Hüllproteine gerichtet sind	32
3.3.3 Polyklonales Peptidantiserum, das gegen den Carboxyterminus von 17kT gerichtet ist	33
3.3.4 Sekundäre Antikörper	33
3.4 Nukleinsäuren	33
3.4.1 Plasmide	33
3.4.2 Oligonukleotide	35
3.5 Enzyme	36
3.6 Chemikalien und Biochemikalien	37
4 METHODEN	39
4.1 Zellkultur und zellanalytische Techniken	39
4.1.1 Zellkultur von Zellinien	39
4.1.2 Passagieren von adhärent und in Suspension wachsenden Zellkulturen	39
4.1.3 Bestimmung der Zellzahl	39
4.1.4 DNA Transfektion	40
4.1.5 Transiente Kotransfektion von Expressionsvektoren in CV1 Zellen mit der Kalziumphosphatpräzipitationsmethode	40
4.1.6 Transiente Transfektion von eukaryontischen Expressionsvektoren in Zellen und stabile Transfektion von Baculovirusvektoren in Insektenzellen	41
4.1.7 Etablierung DNA-rekombinanter Zellinien	41
4.1.8 Einfrieren von Zellen (Kryokonservierung)	42
4.1.9 Auftauen von Zellen	42
4.2 Virologische Techniken	43
4.2.1 Infektion von Affennierenzellen	43
4.2.2 Abortive Infektion von Nagetierzellen	43
4.2.3 Softagarklonierung	43
4.2.4 Transfektion viraler DNA in Affennierenzellen	44
4.2.5 Herstellung eines 17kT exprimierenden Baculovirus durch Transfektion	44
4.2.6 Herstellung eines SV40 Virusüberstandes	44
4.2.7 Aufkonzentrierung von Virusüberständen	45
4.2.8 Bestimmung der SV40 Infektionseffizienz	45
4.2.9 Indirekte Immunfluoreszenz SV40-infizierter Zellen oder stabil exprimierenden Zellinien	45
4.3 Proteinanalytische Techniken	46
4.3.1. (35S)-Markierung von Proteinen	46
4.3.2 (32P)-Markierung von Proteinen	47
4.3.3 Ernte von eukaryontischen adhärenten Zellen	47
4.3.4 Gesamtzellextraktion	48
4.3.5 Proteinbestimmung nach Bradford	48
4.3.6 Messung der eingebauten Radioaktivität bei radioaktiv markierten Gesamtzellysaten durch Szintillationszählung	48
4.3.7 Aufarbeiten der transfizierten Zellen für den Luziferasetest	49
4.3.8 Immunpräzipitation von Proteinen aus Gesamtzellysaten	49
4.3.9 Vorbereitung der Proben für die Analyse in der SDS-PAGE	50
4.3.10 SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese (SDS-PAGE)	50
4.3.11 Nachweis von radioaktiv markierten Proteinen durch Fluorographie	51
4.3.12 Nachweis von Proteinen durch direkte Anfärbung im Gel	51
4.3.13 Nachweis von Proteinen im Western Blot	51
4.4 Immunologische Techniken	56
4.4.1 Herstellung eines 17kT-spezifischen Peptidantiserums	56
4.4.2 Aufbereitung der Proben für die Immunisierung	57
4.4.3 Immunisierungsstrategie	57
4.4.4 Immunisierungsschema	58
4.4.5 Blutentnahme und Präparation des Serums	58
4.4.6 Austesten der Mausantiseren mit Dot Blot Analyse	58
4.5 DNA-analytische Techniken	59
4.5.1 Herstellung transformationskompetenter Bakterienzellen mit der Mehrionentechnik	59
4.5.2 Transformation von Bakterien mit Plasmid DNA	60
4.5.3 Reinigung von Nukleinsäuren	60
4.5.4 Konzentrationsbestimmung von DNA	62
4.5.5 Restriktionsendonukleolytische Spaltung von DNA	62
4.5.6 Gelelektrophoretische Auftrennung von DNA	62
4.5.7 DNA Elution aus Agarosegelen	63
4.5.8 Reinigung und Konzentrierung von DNA Lösungen	63
4.5.9 Klonierung von DNA	64
4.5.10 DNA Amplifikation durch die Polymerasekettenreaktion (PCR)	65
4.5.11 DNA Sequenzierung	67
4.5.12 Elektrophorese der sequenzierten DNA	68
4.5.13 Radioaktive Markierung von DNA	68
4.6 RNA-analytische Techniken	71
4.6.1 Isolierung von Gesamt RNA aus Zellkulturzellen	71
4.6.2 Quantifizierung der RNA	71
4.6.3 Gelelektrophorese der RNA	71
4.6.4 Northern Blot Analyse	72
5 ERGEBNISSE	74
5.1 Nachweis des SV40 17kDaTumorantigens (17kT) in SV40-transformierten Zellen	74
5.1.1 Der monoklonale Antikörper PAb416 erkennt 17kT	74
5.1.2 Expressionsmuster des 17kT Proteins in SV40-transformierten Zellen	77
5.2 Herstellung eines 17kT-spezifischen Peptidantiserums	79
5.2.1 Das Antiserum KS2 erkennt 17kT Protein aus einer SV40- transformierten Zellinie	79
5.2.2 Spezifische Erkennung des 17kT Proteins in transient transfizierten Affenzellen durch die Antiseren KS1 und KS2	80
5.3 Nachweis des SV40 17kT Proteins in produktiv SV40- infizierten Zellen	82
5.4 Konstruktion eines 17kDa Tumorantigen-defizienten (17kT-) SV40 Virus	84
5.4.1 Auswahl der Punktmutationen für die in vitro Mutagenese zur Herstellung eines 17kT defizienten SV40 Virus	85
5.4.2 Prinzip der in vitro Mutagenese durch Polymerasekettenreaktion (PCR)	87
5.4.3 Klonierung der SV40 Doppelmutante	89
5.4.4 Vermehrung der SV40 Virusmutante in Affennierenzellen	89
5.4.5 Analyse der amplifizierten Virusmutanten	89
5.5 Vergleich von SV40 Wildtyp mit der SV40 (17kT-) Mutante in der produktiven Infektion	92
5.5.1 Expression der viralen RNA in SV40 Wildtyp- und SV40 (17kT-)- infizierten TC7 Zellen	92
5.5.2 Expressionsmuster der viralen Proteine in SV40 Wildtyp- und SV40 (17kT-)-infizierten TC7 Zellen	94
5.5.3 Akkumulation der viralen DNA in SV40 Wildtyp- und SV40 (17kT-)-infizierten TC7 Zellen	96
5.5.4 Virale DNA Syntheseraten in SV40 Wildtyp- und SV40 (17kT-)-infizierten TC7 Zellen	97
5.5.5 Virusfreisetzung in SV40 Wildtyp- und SV40 (17kT-)-infizierten TC7 Zellen	98
5.6 Einfluß von 17kT auf den Verlauf der produktiven Infektion	100
5.6.1 Etablierung stabil 17kT exprimierender Zellinien	100
5.6.2 Analyse der Phänotyps der 17kT stabil exprimierenden TC7 Zellinien	100
5.6.3 Einfluß von 17kT auf die frühe Phase der produktiven SV40 Infektion	101
5.6.4 Analyse der T-Ag mRNA Menge in der frühen Phase der Infektion	101
5.6.4 Analyse der Proteinmenge von T-Ag in der frühen Phase der Infektion	103
5.6.5 Analyse der Proteinsyntheserate von T-Ag und t-Ag in der frühen Phase der SV40 Infektion	104
5.7 Die Rolle von 17kT bei der Transaktivierung des frühen SV40 Promotors	105
5.8 Interaktion von 17kT mit dem Retinoblastomagenprodukt (Rb)	107
6 DISKUSSION	109
6.1 Expression einer autonomen aminoterminalen Domäne des großen Tumorantigens – eine gemeinsame Strategie der DNA Tumorviren?	109
6.1.1 Entdeckung 17kT-verwandter Proteine bei anderen DNA Tumorviren	110
6.1.2 Evolution der DNA Tumorviren	112
6.2 Die Rolle des SV40 17kDa Tumorantigens in der SV40-vermittelten Zelltransformation	113
6.3 Die Rolle des SV40 17kDa Tumorantigens in der SV40 Infektion	116
6.3.1 Nachweis der 17kT Expression in infizierten Zellen	116
6.3.2 Vergleich des SV40 Wildtypvirus mit der SV40 (17kT-) Deletionsmutante in der produktiven SV40 Infektion	116
6.3.3 Einfluß von 17kT auf den Verlauf der produktiven Infektion	118
6.3.4 Transkriptionelle Aktivierung und Repression des frühen SV40 Promotors in der viralen Infektion	121
6.3.5 Mechanismen der transkriptionellen Aktivierung	123
7 ZUSAMMENFASSUNG	126
8 LITERATUR	128
9 ABKÜRZUNGEN	144
DANKSAGUNG	148

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