| 1 EINLEITUNG | 12 |
| 1.1 Das Simian Virus 40 (SV40) | 13 |
| 1.2 Vermehrungsszyklus des SV40 Virus | 14 |
| 1.2.1 Produktive Infektion von SV40 permissiven Zellen | 14 |
| 1.2.2 Nicht produktive, abortive Infektion von nicht permissiven Zellen | 15 |
| 1.3 Struktur und Funktionen der viralen Tumorantigene | 15 |
| 1.3.1 Das große SV40 Tumorantigen (T-Ag) | 15 |
| 1.3.2 Das kleine SV40 Tumorantigen (t-Ag) | 23 |
| 1.3.3 Das SV40 17kDa Tumorantigen | 24 |
| 2 PROBLEMSTELLUNG | 26 |
| 3 MATERIAL | 29 |
| 3.1 Versuchstiere | 29 |
| 3.2 Zellinien | 29 |
| 3.2.1 Affennierenzellinien (SV40 permissiv) | 29 |
| 3.2.2 Humane Zellinien (SV40 semipermissiv) | 30 |
| 3.2.3 Rattenzellinien (SV40 nicht permissiv) | 30 |
| 3.2.4 Mauszellinien (SV40 nicht permissiv) | 31 |
| 3.2.5 Insektenzellen | 31 |
| 3.2.6 Viren | 31 |
| 3.2.7 Bakterienstämme | 32 |
| 3.3 Antikörper | 32 |
| 3.3.1 Monoklonale Antikörper, die gegen SV40 Tumorantigene gerichtet sind | 32 |
| 3.3.2 Polyklonale Antikörper, die gegen SV40 Hüllproteine gerichtet sind | 32 |
| 3.3.3 Polyklonales Peptidantiserum, das gegen den Carboxyterminus von 17kT gerichtet ist | 33 |
| 3.3.4 Sekundäre Antikörper | 33 |
| 3.4 Nukleinsäuren | 33 |
| 3.4.1 Plasmide | 33 |
| 3.4.2 Oligonukleotide | 35 |
| 3.5 Enzyme | 36 |
| 3.6 Chemikalien und Biochemikalien | 37 |
| 4 METHODEN | 39 |
| 4.1 Zellkultur und zellanalytische Techniken | 39 |
| 4.1.1 Zellkultur von Zellinien | 39 |
| 4.1.2 Passagieren von adhärent und in Suspension wachsenden Zellkulturen | 39 |
| 4.1.3 Bestimmung der Zellzahl | 39 |
| 4.1.4 DNA Transfektion | 40 |
| 4.1.5 Transiente Kotransfektion von Expressionsvektoren in CV1 Zellen mit der Kalziumphosphatpräzipitationsmethode | 40 |
| 4.1.6 Transiente Transfektion von eukaryontischen Expressionsvektoren in Zellen und stabile Transfektion von Baculovirusvektoren in Insektenzellen | 41 |
| 4.1.7 Etablierung DNA-rekombinanter Zellinien | 41 |
| 4.1.8 Einfrieren von Zellen (Kryokonservierung) | 42 |
| 4.1.9 Auftauen von Zellen | 42 |
| 4.2 Virologische Techniken | 43 |
| 4.2.1 Infektion von Affennierenzellen | 43 |
| 4.2.2 Abortive Infektion von Nagetierzellen | 43 |
| 4.2.3 Softagarklonierung | 43 |
| 4.2.4 Transfektion viraler DNA in Affennierenzellen | 44 |
| 4.2.5 Herstellung eines 17kT exprimierenden Baculovirus durch Transfektion | 44 |
| 4.2.6 Herstellung eines SV40 Virusüberstandes | 44 |
| 4.2.7 Aufkonzentrierung von Virusüberständen | 45 |
| 4.2.8 Bestimmung der SV40 Infektionseffizienz | 45 |
| 4.2.9 Indirekte Immunfluoreszenz SV40-infizierter Zellen oder stabil exprimierenden Zellinien | 45 |
| 4.3 Proteinanalytische Techniken | 46 |
| 4.3.1. (35S)-Markierung von Proteinen | 46 |
| 4.3.2 (32P)-Markierung von Proteinen | 47 |
| 4.3.3 Ernte von eukaryontischen adhärenten Zellen | 47 |
| 4.3.4 Gesamtzellextraktion | 48 |
| 4.3.5 Proteinbestimmung nach Bradford | 48 |
| 4.3.6 Messung der eingebauten Radioaktivität bei radioaktiv markierten Gesamtzellysaten durch Szintillationszählung | 48 |
| 4.3.7 Aufarbeiten der transfizierten Zellen für den Luziferasetest | 49 |
| 4.3.8 Immunpräzipitation von Proteinen aus Gesamtzellysaten | 49 |
| 4.3.9 Vorbereitung der Proben für die Analyse in der SDS-PAGE | 50 |
| 4.3.10 SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese (SDS-PAGE) | 50 |
| 4.3.11 Nachweis von radioaktiv markierten Proteinen durch Fluorographie | 51 |
| 4.3.12 Nachweis von Proteinen durch direkte Anfärbung im Gel | 51 |
| 4.3.13 Nachweis von Proteinen im Western Blot | 51 |
| 4.4 Immunologische Techniken | 56 |
| 4.4.1 Herstellung eines 17kT-spezifischen Peptidantiserums | 56 |
| 4.4.2 Aufbereitung der Proben für die Immunisierung | 57 |
| 4.4.3 Immunisierungsstrategie | 57 |
| 4.4.4 Immunisierungsschema | 58 |
| 4.4.5 Blutentnahme und Präparation des Serums | 58 |
| 4.4.6 Austesten der Mausantiseren mit Dot Blot Analyse | 58 |
| 4.5 DNA-analytische Techniken | 59 |
| 4.5.1 Herstellung transformationskompetenter Bakterienzellen mit der Mehrionentechnik | 59 |
| 4.5.2 Transformation von Bakterien mit Plasmid DNA | 60 |
| 4.5.3 Reinigung von Nukleinsäuren | 60 |
| 4.5.4 Konzentrationsbestimmung von DNA | 62 |
| 4.5.5 Restriktionsendonukleolytische Spaltung von DNA | 62 |
| 4.5.6 Gelelektrophoretische Auftrennung von DNA | 62 |
| 4.5.7 DNA Elution aus Agarosegelen | 63 |
| 4.5.8 Reinigung und Konzentrierung von DNA Lösungen | 63 |
| 4.5.9 Klonierung von DNA | 64 |
| 4.5.10 DNA Amplifikation durch die Polymerasekettenreaktion (PCR) | 65 |
| 4.5.11 DNA Sequenzierung | 67 |
| 4.5.12 Elektrophorese der sequenzierten DNA | 68 |
| 4.5.13 Radioaktive Markierung von DNA | 68 |
| 4.6 RNA-analytische Techniken | 71 |
| 4.6.1 Isolierung von Gesamt RNA aus Zellkulturzellen | 71 |
| 4.6.2 Quantifizierung der RNA | 71 |
| 4.6.3 Gelelektrophorese der RNA | 71 |
| 4.6.4 Northern Blot Analyse | 72 |
| 5 ERGEBNISSE | 74 |
| 5.1 Nachweis des SV40 17kDaTumorantigens (17kT) in SV40-transformierten Zellen | 74 |
| 5.1.1 Der monoklonale Antikörper PAb416 erkennt 17kT | 74 |
| 5.1.2 Expressionsmuster des 17kT Proteins in SV40-transformierten Zellen | 77 |
| 5.2 Herstellung eines 17kT-spezifischen Peptidantiserums | 79 |
| 5.2.1 Das Antiserum KS2 erkennt 17kT Protein aus einer SV40- transformierten Zellinie | 79 |
| 5.2.2 Spezifische Erkennung des 17kT Proteins in transient transfizierten Affenzellen durch die Antiseren KS1 und KS2 | 80 |
| 5.3 Nachweis des SV40 17kT Proteins in produktiv SV40- infizierten Zellen | 82 |
| 5.4 Konstruktion eines 17kDa Tumorantigen-defizienten (17kT-) SV40 Virus | 84 |
| 5.4.1 Auswahl der Punktmutationen für die in vitro Mutagenese zur Herstellung eines 17kT defizienten SV40 Virus | 85 |
| 5.4.2 Prinzip der in vitro Mutagenese durch Polymerasekettenreaktion (PCR) | 87 |
| 5.4.3 Klonierung der SV40 Doppelmutante | 89 |
| 5.4.4 Vermehrung der SV40 Virusmutante in Affennierenzellen | 89 |
| 5.4.5 Analyse der amplifizierten Virusmutanten | 89 |
| 5.5 Vergleich von SV40 Wildtyp mit der SV40 (17kT-) Mutante in der produktiven Infektion | 92 |
| 5.5.1 Expression der viralen RNA in SV40 Wildtyp- und SV40 (17kT-)- infizierten TC7 Zellen | 92 |
| 5.5.2 Expressionsmuster der viralen Proteine in SV40 Wildtyp- und SV40 (17kT-)-infizierten TC7 Zellen | 94 |
| 5.5.3 Akkumulation der viralen DNA in SV40 Wildtyp- und SV40 (17kT-)-infizierten TC7 Zellen | 96 |
| 5.5.4 Virale DNA Syntheseraten in SV40 Wildtyp- und SV40 (17kT-)-infizierten TC7 Zellen | 97 |
| 5.5.5 Virusfreisetzung in SV40 Wildtyp- und SV40 (17kT-)-infizierten TC7 Zellen | 98 |
| 5.6 Einfluß von 17kT auf den Verlauf der produktiven Infektion | 100 |
| 5.6.1 Etablierung stabil 17kT exprimierender Zellinien | 100 |
| 5.6.2 Analyse der Phänotyps der 17kT stabil exprimierenden TC7 Zellinien | 100 |
| 5.6.3 Einfluß von 17kT auf die frühe Phase der produktiven SV40 Infektion | 101 |
| 5.6.4 Analyse der T-Ag mRNA Menge in der frühen Phase der Infektion | 101 |
| 5.6.4 Analyse der Proteinmenge von T-Ag in der frühen Phase der Infektion | 103 |
| 5.6.5 Analyse der Proteinsyntheserate von T-Ag und t-Ag in der frühen Phase der SV40 Infektion | 104 |
| 5.7 Die Rolle von 17kT bei der Transaktivierung des frühen SV40 Promotors | 105 |
| 5.8 Interaktion von 17kT mit dem Retinoblastomagenprodukt (Rb) | 107 |
| 6 DISKUSSION | 109 |
| 6.1 Expression einer autonomen aminoterminalen Domäne des großen Tumorantigens – eine gemeinsame Strategie der DNA Tumorviren? | 109 |
| 6.1.1 Entdeckung 17kT-verwandter Proteine bei anderen DNA Tumorviren | 110 |
| 6.1.2 Evolution der DNA Tumorviren | 112 |
| 6.2 Die Rolle des SV40 17kDa Tumorantigens in der SV40-vermittelten Zelltransformation | 113 |
| 6.3 Die Rolle des SV40 17kDa Tumorantigens in der SV40 Infektion | 116 |
| 6.3.1 Nachweis der 17kT Expression in infizierten Zellen | 116 |
| 6.3.2 Vergleich des SV40 Wildtypvirus mit der SV40 (17kT-) Deletionsmutante in der produktiven SV40 Infektion | 116 |
| 6.3.3 Einfluß von 17kT auf den Verlauf der produktiven Infektion | 118 |
| 6.3.4 Transkriptionelle Aktivierung und Repression des frühen SV40 Promotors in der viralen Infektion | 121 |
| 6.3.5 Mechanismen der transkriptionellen Aktivierung | 123 |
| 7 ZUSAMMENFASSUNG | 126 |
| 8 LITERATUR | 128 |
| 9 ABKÜRZUNGEN | 144 |
| DANKSAGUNG | 148 |
