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Die Rolle des SV 40 17kDa Tumorantigens in der produktiven SV 40 Infektion und der SV 40-vermittelten Zelltransformation

AutorKatja Scheidig
VerlagVerlag für Wissenschaft und Forschung
Erscheinungsjahr1999
Seitenanzahl151 Seiten
ISBN9783897000797
FormatPDF
KopierschutzDRM
GerätePC/MAC/eReader/Tablet
Preis29,90 EUR
Das Simian Virus 40 (SV 40) dient seit langem als einfaches Modellsystem, um komplexe zelluläre Ereignisse zu erforschen. Von besonderer Bedeutung ist die Untersuchung der Meschanismen der Tumorentstehung (Zelluläre Transformation) und der Virusvermehrung (produktive Infektion). Die vielfältigen Funktionen, die SV40 in der Infektion und Transformation wahrnimmt, beruht auf der Expression regulatorischer Proteine (Tumorantigene), die von der frühen Region des Virusgenoms kodiert werden. Ei drittes frühes SV40 Protein, das SV40 17kDa Tumorantigen (17 kT), wurde 1993 isoliert. Die Charakterisierung von 17 kT sowie die Aufklärung seiner biologischen Funktionen ist das Thema dieser Untersuchung.   

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Inhaltsverzeichnis
1 EINLEITUNG12
1.1 Das Simian Virus 40 (SV40)13
1.2 Vermehrungsszyklus des SV40 Virus14
1.2.1 Produktive Infektion von SV40 permissiven Zellen14
1.2.2 Nicht produktive, abortive Infektion von nicht permissiven Zellen15
1.3 Struktur und Funktionen der viralen Tumorantigene15
1.3.1 Das große SV40 Tumorantigen (T-Ag)15
1.3.2 Das kleine SV40 Tumorantigen (t-Ag)23
1.3.3 Das SV40 17kDa Tumorantigen24
2 PROBLEMSTELLUNG26
3 MATERIAL29
3.1 Versuchstiere29
3.2 Zellinien29
3.2.1 Affennierenzellinien (SV40 permissiv)29
3.2.2 Humane Zellinien (SV40 semipermissiv)30
3.2.3 Rattenzellinien (SV40 nicht permissiv)30
3.2.4 Mauszellinien (SV40 nicht permissiv)31
3.2.5 Insektenzellen31
3.2.6 Viren31
3.2.7 Bakterienstämme32
3.3 Antikörper32
3.3.1 Monoklonale Antikörper, die gegen SV40 Tumorantigene gerichtet sind32
3.3.2 Polyklonale Antikörper, die gegen SV40 Hüllproteine gerichtet sind32
3.3.3 Polyklonales Peptidantiserum, das gegen den Carboxyterminus von 17kT gerichtet ist33
3.3.4 Sekundäre Antikörper33
3.4 Nukleinsäuren33
3.4.1 Plasmide33
3.4.2 Oligonukleotide35
3.5 Enzyme36
3.6 Chemikalien und Biochemikalien37
4 METHODEN39
4.1 Zellkultur und zellanalytische Techniken39
4.1.1 Zellkultur von Zellinien39
4.1.2 Passagieren von adhärent und in Suspension wachsenden Zellkulturen39
4.1.3 Bestimmung der Zellzahl39
4.1.4 DNA Transfektion40
4.1.5 Transiente Kotransfektion von Expressionsvektoren in CV1 Zellen mit der Kalziumphosphatpräzipitationsmethode40
4.1.6 Transiente Transfektion von eukaryontischen Expressionsvektoren in Zellen und stabile Transfektion von Baculovirusvektoren in Insektenzellen41
4.1.7 Etablierung DNA-rekombinanter Zellinien41
4.1.8 Einfrieren von Zellen (Kryokonservierung)42
4.1.9 Auftauen von Zellen42
4.2 Virologische Techniken43
4.2.1 Infektion von Affennierenzellen43
4.2.2 Abortive Infektion von Nagetierzellen43
4.2.3 Softagarklonierung43
4.2.4 Transfektion viraler DNA in Affennierenzellen44
4.2.5 Herstellung eines 17kT exprimierenden Baculovirus durch Transfektion44
4.2.6 Herstellung eines SV40 Virusüberstandes44
4.2.7 Aufkonzentrierung von Virusüberständen45
4.2.8 Bestimmung der SV40 Infektionseffizienz45
4.2.9 Indirekte Immunfluoreszenz SV40-infizierter Zellen oder stabil exprimierenden Zellinien45
4.3 Proteinanalytische Techniken46
4.3.1. (35S)-Markierung von Proteinen46
4.3.2 (32P)-Markierung von Proteinen47
4.3.3 Ernte von eukaryontischen adhärenten Zellen47
4.3.4 Gesamtzellextraktion48
4.3.5 Proteinbestimmung nach Bradford48
4.3.6 Messung der eingebauten Radioaktivität bei radioaktiv markierten Gesamtzellysaten durch Szintillationszählung48
4.3.7 Aufarbeiten der transfizierten Zellen für den Luziferasetest49
4.3.8 Immunpräzipitation von Proteinen aus Gesamtzellysaten49
4.3.9 Vorbereitung der Proben für die Analyse in der SDS-PAGE50
4.3.10 SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese (SDS-PAGE)50
4.3.11 Nachweis von radioaktiv markierten Proteinen durch Fluorographie51
4.3.12 Nachweis von Proteinen durch direkte Anfärbung im Gel51
4.3.13 Nachweis von Proteinen im Western Blot51
4.4 Immunologische Techniken56
4.4.1 Herstellung eines 17kT-spezifischen Peptidantiserums56
4.4.2 Aufbereitung der Proben für die Immunisierung57
4.4.3 Immunisierungsstrategie57
4.4.4 Immunisierungsschema58
4.4.5 Blutentnahme und Präparation des Serums58
4.4.6 Austesten der Mausantiseren mit Dot Blot Analyse58
4.5 DNA-analytische Techniken59
4.5.1 Herstellung transformationskompetenter Bakterienzellen mit der Mehrionentechnik59
4.5.2 Transformation von Bakterien mit Plasmid DNA60
4.5.3 Reinigung von Nukleinsäuren60
4.5.4 Konzentrationsbestimmung von DNA62
4.5.5 Restriktionsendonukleolytische Spaltung von DNA62
4.5.6 Gelelektrophoretische Auftrennung von DNA62
4.5.7 DNA Elution aus Agarosegelen63
4.5.8 Reinigung und Konzentrierung von DNA Lösungen63
4.5.9 Klonierung von DNA64
4.5.10 DNA Amplifikation durch die Polymerasekettenreaktion (PCR)65
4.5.11 DNA Sequenzierung67
4.5.12 Elektrophorese der sequenzierten DNA68
4.5.13 Radioaktive Markierung von DNA68
4.6 RNA-analytische Techniken71
4.6.1 Isolierung von Gesamt RNA aus Zellkulturzellen71
4.6.2 Quantifizierung der RNA71
4.6.3 Gelelektrophorese der RNA71
4.6.4 Northern Blot Analyse72
5 ERGEBNISSE74
5.1 Nachweis des SV40 17kDaTumorantigens (17kT) in SV40-transformierten Zellen74
5.1.1 Der monoklonale Antikörper PAb416 erkennt 17kT74
5.1.2 Expressionsmuster des 17kT Proteins in SV40-transformierten Zellen77
5.2 Herstellung eines 17kT-spezifischen Peptidantiserums79
5.2.1 Das Antiserum KS2 erkennt 17kT Protein aus einer SV40- transformierten Zellinie79
5.2.2 Spezifische Erkennung des 17kT Proteins in transient transfizierten Affenzellen durch die Antiseren KS1 und KS280
5.3 Nachweis des SV40 17kT Proteins in produktiv SV40- infizierten Zellen82
5.4 Konstruktion eines 17kDa Tumorantigen-defizienten (17kT-) SV40 Virus84
5.4.1 Auswahl der Punktmutationen für die in vitro Mutagenese zur Herstellung eines 17kT defizienten SV40 Virus85
5.4.2 Prinzip der in vitro Mutagenese durch Polymerasekettenreaktion (PCR)87
5.4.3 Klonierung der SV40 Doppelmutante89
5.4.4 Vermehrung der SV40 Virusmutante in Affennierenzellen89
5.4.5 Analyse der amplifizierten Virusmutanten89
5.5 Vergleich von SV40 Wildtyp mit der SV40 (17kT-) Mutante in der produktiven Infektion92
5.5.1 Expression der viralen RNA in SV40 Wildtyp- und SV40 (17kT-)- infizierten TC7 Zellen92
5.5.2 Expressionsmuster der viralen Proteine in SV40 Wildtyp- und SV40 (17kT-)-infizierten TC7 Zellen94
5.5.3 Akkumulation der viralen DNA in SV40 Wildtyp- und SV40 (17kT-)-infizierten TC7 Zellen96
5.5.4 Virale DNA Syntheseraten in SV40 Wildtyp- und SV40 (17kT-)-infizierten TC7 Zellen97
5.5.5 Virusfreisetzung in SV40 Wildtyp- und SV40 (17kT-)-infizierten TC7 Zellen98
5.6 Einfluß von 17kT auf den Verlauf der produktiven Infektion100
5.6.1 Etablierung stabil 17kT exprimierender Zellinien100
5.6.2 Analyse der Phänotyps der 17kT stabil exprimierenden TC7 Zellinien100
5.6.3 Einfluß von 17kT auf die frühe Phase der produktiven SV40 Infektion101
5.6.4 Analyse der T-Ag mRNA Menge in der frühen Phase der Infektion101
5.6.4 Analyse der Proteinmenge von T-Ag in der frühen Phase der Infektion103
5.6.5 Analyse der Proteinsyntheserate von T-Ag und t-Ag in der frühen Phase der SV40 Infektion104
5.7 Die Rolle von 17kT bei der Transaktivierung des frühen SV40 Promotors105
5.8 Interaktion von 17kT mit dem Retinoblastomagenprodukt (Rb)107
6 DISKUSSION109
6.1 Expression einer autonomen aminoterminalen Domäne des großen Tumorantigens – eine gemeinsame Strategie der DNA Tumorviren?109
6.1.1 Entdeckung 17kT-verwandter Proteine bei anderen DNA Tumorviren110
6.1.2 Evolution der DNA Tumorviren112
6.2 Die Rolle des SV40 17kDa Tumorantigens in der SV40-vermittelten Zelltransformation113
6.3 Die Rolle des SV40 17kDa Tumorantigens in der SV40 Infektion116
6.3.1 Nachweis der 17kT Expression in infizierten Zellen116
6.3.2 Vergleich des SV40 Wildtypvirus mit der SV40 (17kT-) Deletionsmutante in der produktiven SV40 Infektion116
6.3.3 Einfluß von 17kT auf den Verlauf der produktiven Infektion118
6.3.4 Transkriptionelle Aktivierung und Repression des frühen SV40 Promotors in der viralen Infektion121
6.3.5 Mechanismen der transkriptionellen Aktivierung123
7 ZUSAMMENFASSUNG126
8 LITERATUR128
9 ABKÜRZUNGEN144
DANKSAGUNG148

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