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Etablierung eines In vitro-Modells der Mastzelldifferenzierung zur Untersuchung der T1-Funktion

AutorBrigitte Rupp
VerlagVerlag für Wissenschaft und Forschung
Erscheinungsjahr2000
Seitenanzahl179 Seiten
ISBN9783897002579
FormatPDF
KopierschutzDRM
GerätePC/MAC/eReader/Tablet
Preis34,90 EUR
Die murine Mastzellinie L138.8A kann durch Kultivierung mit verschiedenen Wachstumsfaktoren in Richtung reifer Mastzellen differenziert werden und ist damit ein geeignetes in vitro-System zur Untersuchung der Mastzelldifferenzierung. Dabei stellten sich die Oberflächenexpression von Mastzellmarkern, die Alcianblau-Färbung und die Transkriptmenge an mastzellspezifischen Serinproteasen als nützliche Bestimmungsmerkmale heraus. T1-M, ein Interleukin-1-Rezeptor-Homolog, scheint in L138.8A-Zellen mit der Expression der differenzierungsspezifischen Tryptase MMCP-6 verbunden zu sein. Weiter scheint die Suppression der T1-Expression in einer Osteosarkomzellinie zu einer erhöhten Degranulationsrate der im Tumor lokalisierten Mastzellen zu führen. So könnte T1-M über einen Einfluß auf Mastzelldifferenzierung und -aktivierung die Tumorabstoßung modulieren.    

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Inhaltsverzeichnis
Inhaltsverzeichnis4
I. Abkürzungsverzeichnis10
II. Einleitung14
1. Mastzellheterogenität14
2. Primäre Mastzellkulturen der Maus15
3. Humane Mastzellen17
4. Isolierung einer natürlichen Mastzellvorläuferpopulation bei Mäusen17
5. Oberflächenmarker der Mastzellen18
5.1 FceRI18
5.2 Kit-Rezeptor19
5.3 T120
6. „Progressives” Mastzellmodell der Maus25
7. Mastzellen in Tumoren26
8. Ziel der Arbeit27
III. Material und Methoden28
1. Mikroorganismen, Zellen und Viren28
1.1 Bakterien28
1.2 Eukaryontische Zellen und Zellinien28
1.3 Baculoviren29
2. Bakterienkultur30
2.1 Nährmedien und Lösungen30
2.2 Anzucht und Konservierung von Bakterien30
3. Kultivierung von Säugerzellen31
3.1 Nährmedien und Lösungen31
3.2 Anzucht und Konservierung von Adhäsions- und Suspensionskulturen33
3.3 Präparation und Anzucht von Primärzellen aus dem Knochenmark34
3.4 Reinigung von Suspensionszellen über einen Fikoll-Dichtegradienten34
3.5 Kokultur34
3.6 Test auf Chemotaxis34
3.7 Gewinnung eines IL-3-haltigen Zellkulturüberstandes36
3.8 Gewinnung konditionierter Medien36
4. Anfärben von Zellen36
4.1 Vitalfärbung mit Trypanblau36
4.2 Bestimmung der Zellzahl mit einem MTT-Test36
4.3 Benzidin-Reaktion mit NTMB37
5. Insektenzell-/Baculovirussystem38
5.1 Nährmedien und Lösungen38
5.2 Anzucht und Konservierung von Insektenzellen38
5.3. Transfektion39
5.4 Virusamplifikation und -lagerung39
5.5 Baculovirusinfektion zur Proteingewinnung39
6. Proteinreinigung aus Insektenzellkulturüberständen39
7. Vektoren, Plasmidkonstrukte und Oligonukleotide40
7.1 Vektoren40
7.1.1 Prokaryontische Vektoren40
7.1.2 Eukaryontische Vektoren40
7.2 Konstrukte41
7.2.1 Konstrukte in prokaryontischen Vektoren41
7.2.2 Konstrukte in eukaryontischen Vektoren42
7.3 Oligonukleotide46
7.3.1 Oligonukleotide für PCR-Analysen und -Klonierungen46
7.3.2 Oligonukleotide für Gel-Retentionsanalysen49
8. Isolierung und Reinigung von Nukleinsäuren49
8.1 Plasmide und Vektoren49
8.1.1 Minipräparation mit alkalischer Lyse49
8.1.2 Plasmidisolierung im gröfleren Maflstab50
8.2 Isolierung von RNS50
8.3 Präparation von genomischer DNS51
8.4 Photometrische Bestimmung der Reinheit und Konzentration von Nukleinsäuren51
9. Gelelektrophoretische Auftrennung von Nukleinsäuren52
9.1 Auftrennung von DNS im Agarose-Gel52
9.2 Aufreinigung von DNS-Fragmenten aus Agarose-Gelen52
9.3 Auftrennung von DNS im Polyacrylamid-Gel52
9.4 Auftrennung von RNS im Agarose-Gel53
10. Transfer von Nukleinsäuren auf Membranen54
10.1 Transfer von DNS auf Membranen („Southern Blot“)54
10.2 Transfer von RNS auf Membranen („Northern Blot“)54
10.3 Übertragung von Bakterien-Kolonien auf Membranen54
11. Enzymatische Reaktionen an Nukleinsäuren55
11.1 Spaltung von DNS mit Restriktionsendonukleasen55
11.2 Auffüllen einzelsträngiger Enden mit der Klenow-Polymerase55
11.3 Dephosphorylierung von DNS mit alkalischer Phosphatase55
11.4 Ligation56
12. Markierung von Nukleinsäuren56
12.1 Markierung von DNS mit Digoxigenin56
12.2 Radioaktive Markierung57
12.2.1 Zufällige Markierung von DNS mit der Klenow–Polymerase57
12.2.2 Endmarkierung von Oligonukleotiden mit der T4-Polynukleotidkinase57
12.2.3 Markierung von cDNS durch reverse Transkription58
13. Hybridisierung von membrangebundenen Nukleinsäuren58
13.1 Radioaktive Hybridisierung58
13.2 Hybridisierung mit einer Digoxigenin-markierten Sonde59
14. Polymerase-Kettenreaktion (PCR)60
14.1 Reverse PCR (RT-PCR)60
14.2 Amplifikation von Plasmid-DNS61
14.3 Amplifikation von Baculovirus-DNS61
15. Transformation von Bakterien62
15.1 Rubidiumchlorid-Methode62
15.1.1 Herstellung kompetenter Bakterien62
15.1.2 Transformation mit Hitzeschock63
15.2 Elektroporation63
15.2.1 Herstellung elektrokompetenter Bakterien63
15.2.2 Transformation durch Elektroporation63
16. Transfektion eukaryontischer Zellen64
16.1 Elektroporation64
16.2 Lipofektion64
16.3 Selektion stabiler Transfektanden65
16.4 Induktion der Genexpression in einem TetOff-System65
17. Luminometrische Messung der Promotoraktivitäten65
17.1 Messung der Luciferase-Reporteraktivität66
17.2 Messung der SEAP-Reporteraktivität66
18. Analyse von Proteinen66
18.1 Konzentrationsbestimmung mit Bradford-Reagenz66
18.2 Immunpräzipitation67
18.3 SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE)67
18.4 Übertragung von Proteinen auf Nylonmembranen („Western Blot“)68
18.5 Hybridisierung von membrangebundenen Proteinen69
19.70
20. Gel-Retentionsanalyse71
20.1 Gewinnung der Kernextrakte71
20.2 Durchführung der Gel-Retentionsanalyse71
20.2.1 Vorbereitung und Markierung der doppelsträngigen Oligonukleotide71
20.2.2 Reaktion der Oligonukleotide mit den Kernextrakten72
20.2.3 Elektrophoretische Auftrennung der Komplexe und Autoradiographie72
21. Nachweis der Enzymaktivität der Tryptase73
22. Immunhistochemie74
22.1 Herstellung von Zytospinpräparaten74
22.2 Fixierung von Zytospinpräparaten und Tumormaterial75
22.3 Hybridisierung und Färbung der Präparate75
22.3.1 Immunreaktion75
22.3.2 Anfärbung der Präparate durch alkalische Phosphatase76
22.3.3 Hämatoxylin-Gegenfärbung76
22.4 Chloracetat-Esterase-Färbung77
22.5 Mastzellfärbungen77
22.5.1 Giemsa-Färbung77
22.5.2 Alcianblau- und Safranin-Färbung78
23. Durchfluflzytometrie (FACS)78
24. Anhang: Bezugsquellen von Chemikalien und Zellkulturmaterial80
IV. Ergebnisse82
A. Murines Osteosarkommodell82
1. Osteosarkommodell82
1.1 Mastzellen in durch Osteosarkomzellinien induzierten Tumoren82
1.2 Mastzellen in Tumoren nach T1-Antisense-Expression85
1.3 Chemotaxis der Mastzellen87
1.4 Kokultur von Osteosarkomzellinien mit Mastzellinien87
B. Murines Mastzellmodell89
2. Charakterisierung der L138.8A als Mastzellvorläuferzellinie mit Differenzierungspotential unter Einflufl von IL-3, IL-9, IL-10 und KL89
2.1 Kinetik des Wachstums von L138.8A-Zellen auf IL-3 oder KL89
2.2 Oberflächenexpression von Thy-1.2, Kit, FceRI und T191
2.3 Alcianblau-/Safraninfärbungen96
2.4 Immunhistochemischer Nachweis der Tryptase an Zytospinpräparaten98
2.5 Enzymaktivität der Tryptase99
2.6 Expression von MMCP-1, MMCP-2, MMCP-4, FceRIa und Granzym B100
2.7 Expression von MMCP-6 und MMCP-7102
2.8 Keine Expression von MMCP-6 in der autonomen Mastzellinie P815103
3. Charakterisierung der MMCP-6-Regulation in L138.8A-Zellen104
3.1 Kinetik der KL-induzierten Expression von MMCP-6104
3.2 Halbwertszeit der mRNS von MMCP-6105
4. Modulation der T1-Expression in L138.8A105
4.1 T1sense- und T1antisense-Konstrukte106
4.2 Transiente und stabile Transfektionen106
5. „Liganden-Modulation“ bei hämatopoetischen Zellinien108
5.1 Proliferation hämatopoetischer Zellinien108
5.2 Differenzierung erythroider Zellinien109
5.3 Expression von T1 und MMCP-6110
6. Klonierung von Hybridrezeptoren, Rezeptoren und Deletionsmutanten111
6.1 Klonierungen112
6.1.1 Klonierung des Hybrids ILT1 und der Deletionsmutante ILT1. K112
6.1.2 Klonierung der Deletionsmutanten des T1-M-Rezeptors113
6.1.3 Klonierung des IL-1RI-Rezeptors und der Deletionsmutante IL- 1R. P114
6.2 Nachweis der Konstrukte auf Proteinebene115
6.3 Expressionsnachweis der mRNS nach Transfektion116
6.4 Aktivierung des Transkriptionsfaktors NF.B in transfizierten Zellen117
7. Transfektion der Rezeptorkonstrukte118
7.1 Expression des IL-1RI und des IL-1RAcP in hämatopoetischen Zellinien118
7.2 Induktion von MMCP-6 in L138.8A-Zellen119
7.2.1 Keine Abhängigkeit von IL-1119
7.2.2 Kein spezifischer Effekt von TPA120
7.2.3 Erhöhter Effekt der Deletionsmutanten121
7.3 Transfektion der faktorunabhängigen Mastzellinie P815121
7.4 Transfektion der faktorabhängigen, myeloiden Zellinie 32Dc1.23122
7.5 Überprüfung des Signalwegs von c-123
7.5.1 Expression des Kit-Rezeptors und KL123
7.5.2 Bindungsverhalten des124
C. Humanes Mastzellmodell125
8. Charakterisierung der T1- und125
8.1 Konstitutive Expression mehrerer Isoformen von T1125
8.2 Keine Expressionsänderung von T1 und126
8.3 Nachweis der Tryptase auf Proteinebene nach Kultivierung mit KL127
8.3.1 Immunhistochemie an Zytospinpräparaten127
8.3.2 Enzymaktivität128
8.4 Expression der Tryptase nach Transfektion der Transkriptionsfaktoren MITF129
8.5 Expression von T1 und130
9. MMCP-6-Promotoranalysen in HMC-1-Zellen131
9.1 Klonierung des MMCP-6-Promotors und der Deletionsmutanten131
9.2 Basale Promotoraktivität der MMCP-6-Promotorkonstrukte133
9.3 Induktion der MMCP-6-Promotorkonstrukte133
9.3.1 Induktion durch KL134
9.3.2 Induktion durch IL- 1fl134
9.3.3 Inhibition des IL- 1fl- Effekts durch einen Inhibitor der p38- MAPK136
V. Diskussion140
1. Osteosarkommodell140
2. Mastzellmodelle141
2.1 Die Mastzellinie L138.8A als differenzierungsfähiges Modellsystem141
2.2 Charakterisierung der Tryptase-Regulation in Mastzellen145
2.3 Geringe Transfektionseffizienz bei L138.8A-Mastzellen147
2.4 Untersuchung der T1-M-Funktion in Mastzellen148
2.5 Signalweg der MMCP-6-Expression152
3. Hypothese zur T1-Funktion im Osteosarkom157
4. Ausblick158
VI. Zusammenfassung161
VII. Literaturverzeichnis162
VIII. Anhang179

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