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E-Book

Romeis - Mikroskopische Technik

AutorBenno Romeis, Peter Böck
VerlagSpektrum Akademischer Verlag
Erscheinungsjahr2010
Seitenanzahl551 Seiten
ISBN9783827422545
FormatPDF
KopierschutzWasserzeichen/DRM
GerätePC/MAC/eReader/Tablet
Preis59,99 EUR
Der ROMEIS ist seit fast 100 Jahren das Standardwerk der mikroskopischen Technik. Über 17 Auflagen hat dieses Methodenbuch die Entwicklung der lichtmikroskopischen Verfahren begleitet und ist bis heute ein unverzichtbares Laborhandbuch für alle Mediziner, Biologen, Mikrobiologen und Chemiker, die cytologische, histologische, pathologische oder histochemische Forschung betreiben. Der Inhalt der 18. Auflage des ROMEIS wurde aktualisiert und um viele moderne Methoden und Anwendungen der Mikroskopie erweitert.

Herausgegeben von:

Priv. Doz. Dr. Maria Mulisch, geb. 1952 in Braunschweig/Niedersachsen. 1973-1974 Studium der Philosophie in Heidelberg; 1974-1980 Studium der Biologie in Heidelberg; 1983 Promotion; 1993 Habilitation. Forschungsschwerpunkt: Protozoologie. Seit 2001 Wissenschaftliche Leiterin der Zentralen Mikroskopie im Biologiezentrum der CAU Kiel. Arbeitsschwerpunkte: Licht- und elektronenmikroskopische Präparationen Immunlokalisationen und Analysen an biologischen Proben, Duchführung von Lehrveranstaltungen für Studenten und Anwender in den Bereichen Licht- und Elektronenmikroskopie.

Prof. Dr. rer. nat. Dr. med. Ulrich Welsch, geb. 1940 in Neustadt/Holstein. 1960-1966 Studium der Anglistik und Biologie in München und Kiel; 1974-1981Studium der Humanmedizin in Kiel; 1983 Approbation. 1984 Vorstand des Lehrstuhls 2 (Cytologie, Histologie, Mikroskopische Anatomie) an der Anatomischen Anstalt der LMU München. Etwa 350 Originalarbeiten u.a. zu den Themen: Vergleichende Mikroskopische Anatomie der Deuterostomier, mutabiles Bindegewebe, Morphologie der Gymnophionen, Zellbiologie der Milch und der Milchdrüse, apokrine Sekretion in Duftdrüsen der Säugetiere.

Mit Beiträgen von:

  • Dr. Erna Aescht ( Oberösterreichisches Landesmuseum, Biologiezentrum, Linz-Dornach )
  • Frau Simone Buechl ( Akademie für medizinische Berufe, MTLA Schule, Ulm-Wiblingen )
  • Frau Anja Burmester ( Kiel )
  • Prof. Dr. Christine Desel ( Botanisches Institut und Botanischer Garten, Christian-Albrechts-Universität Kiel )
  • Dr. Christoph Hamers ( Nikon GmbH Geschäftsbereich Mikroskope, Düsseldorf )
  • Dr. Guido Jach ( Phytowelt Greentechnologies GmbH, Köln )
  • Dr. Manfred Kässens ( Olympus Soft Imaging Solutions, Münster )
  • Priv. Doz. Dr. Barbara E. Nixdorf-Bergweiler (Institut für Physiologie, Christian-Albrechts-Universität Kiel )
  • Herr Stefan Pfeiffer ( Microscopy Services Dähnhardt, Flintbek )
  • Herr Detlef Pütz ( Nikon GmbH Geschäftsbereich Mikroskope, Düsseldorf )
  • Herr Bernd Riedelsheimer ( Anatomische Anstalt der Universität München)
  • Dr. Frank van den Boom ( Nikon GmbH Geschäftsbereich Mikroskope, Düsseldorf )
  • Dr. Rainer Wegerhoff ( Olympus Life and Material Science Europa GmbH, Hamburg )

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Blick ins Buch
Inhaltsverzeichnis
Title Page3
Copyright Page4
Autoren5
Benno Romeis (1888 - 1971)7
Vorwort der Herausgeber8
Table of Contents10
1 Mikroskopische Verfahren12
1.1 Lichtmikroskopie12
1.1.1 Die Geschichte des Mikroskops12
1.1.2 Einführung in die Physik des Lichtes13
1.1.2.1 Licht14
1.1.2.2 Brechung, Beugung, Interferenz und Polarisation14
1.1.2.3 Brechung und Brechungsindex15
1.1.2.4 Beugung und Interferenz15
1.1.2.5 Polarisation15
1.1.3 Die Hauptkomponenten des Mikroskops15
1.1.4 Wie entsteht die Vergrößerung17
1.1.5 Die Objektive18
1.1.5.1 Korrektur der chromatischen Aberration und der Bildwölbung18
1.1.5.2 Auflösung, Schärfentiefe, Arbeitsabstand19
1.1.6 Kondensoren für die Durchlichtmikroskopie21
1.1.7 Grundsätzliche Einstellungen für die Mikroskopie21
1.1.8 Die Köhlersche Beleuchtung21
1.1.9 Kontrastmethoden22
1.1.9.1 Dunkelfeld22
1.1.9.2 Phasenkontrast24
1.1.10 Relieferzeugende Kontrastmethoden26
1.1.10.1 Schrägbeleuchtung26
1.1.10.2 Modulationskontrast26
1.1.10.3 Differenzieller Interferenzkontrast (DIC)27
1.1.11 Stereomikroskopie29
1.1.12 Fluoreszenzmikroskopie31
1.1.12.1 Prinzip der Fluoreszenz31
1.1.12.2 Hauptkomponenten im Fluoreszenzmikroskop31
1.1.13 Konfokale Mikroskopie33
1.1.14 Multiphotonenmikroskopie35
1.1.15 TIRF35
1.1.16 Luminiszenzmikroskopie36
1.2 Elektronenmikroskopie36
1.2.1 Einleitung36
1.2.1.1 Die Anfänge der Elektronenmikroskopie36
1.2.1.2 Das Auflösungsvermögen in der Elektronenmikroskopie37
1.2.2 Transmissionselektronenmikroskopie37
1.2.2.1 Elektronenstrahlquelle38
1.2.2.2 Elektromagnetische Linsen40
1.2.2.3 Strahl-Probe-Wechselwirkungen40
1.2.2.4 Kontrastarten41
1.2.2.5 Beobachtung und Aufzeichnung des Bildes43
1.2.2.6 Probenpräparation43
1.2.2.7 Analysemethoden43
1.2.3 Elektronentomografie43
1.2.4 EFTEM44
1.2.5 REM und ESEM45
1.2.5.1 Grundsätzlicher Aufbau und Funktionsweise45
1.2.5.2 Wechselwirkungen zwischen Elektronenstrahl und Präparat46
1.2.5.3 Detektion47
1.2.5.4 Vergrößerung und Auflösungsvermögen48
1.2.5.5 Anwendungen und Probenpräparation48
1.2.5.6 ESEM – Rasterelektronenmikroskopie unter Umgebungsbedingungen48
1.2.6 Rastersondenmikroskopie49
1.2.6.1 Rastertunnelmikroskopie49
1.2.6.2 Rasterkraftmikroskopie49
2 Präparationsmethoden50
2.1 Mikroskopische Untersuchungen von nativem Material50
2.1.1 Arbeiten mit Lebendmaterial50
2.1.1.1 Voraussetzungen für das Arbeiten mit Lebendpräparaten50
2.1.1.2 Präparationsbeispiele für die Herstellung von Lebendpräparaten51
2.1.1.2.1 Kulturen, Mikroorganismen und Kleinstlebewesen51
2.1.1.2.2 Micro-Life-Objektträger für die Untersuchung aquatischer Kleinstlebewesen51
2.1.1.2.3 Objektträger der Serie „? slide I “für die Beobachtung von Zellkulturen52
2.1.1.2.4 Pflanzliche Präparate52
2.1.1.2.5 Hirnschnittpräparate und Gewebekulturen52
2.1.2 Durchführung von physiologischen Versuchen und Vitalfärbung53
2.1.2.1 Einteilungen der Vitalfärbung53
2.1.2.2 Eigenschaften von Vitalfarbstoffe53
2.1.2.3 Vitalfarbstoffe für die Untersuchung in der Hellfeldmikroskopie54
2.1.2.3.1 Trypanblau54
2.1.2.3.2 Alizarin55
2.1.2.3.3 Janusgrün55
2.1.2.3.4 Neutralrot55
2.1.2.4 Vitalfarbstoffe für die Untersuchung in der Fluoreszenzmikroskopie56
2.1.2.4.1 Trypanblau56
2.1.2.4.2 Acridinorange56
2.1.2.4.3 Fluoresceindiacetat – Aufnahme von Tracern über die Plasmamembran57
2.1.2.4.4 Zellkernfärbung am lebenden Präparat mit Hoechst und DRAQ558
2.1.2.4.5 Zellkernfärbung mit DAPI59
2.1.3 Live-Cell-Imaging59
2.1.3.1 Videofluoreszenzmikroskopie60
2.1.3.1.1 Organellenmarker60
2.1.3.2 Calcium-Imaging61
2.1.3.3 Weitere Methoden des Live-Cell-Imaging (FLIM, FLIP, FRAP, FCS, TIRFM, FRET und BRET)62
2.1.3.3.1 Fluorescence lifetime imaging microscopy, FLIM62
2.1.3.3.2 Fluorescence loss in photobleaching, FLIP und fluorescence recovery after photobleaching, FRAP62
2.1.3.3.3 Fluorescence correlation spectroscopy, FCS62
2.1.3.3.4 Total internal reflection fluorescence microscopy, TIRFM63
2.1.3.3.5 Fluorescence resonance energy transfer, FRET63
2.1.3.3.6 Bioluminescence resonance energy transfer, BRET63
2.1.3.4 Nachweis reaktiver Sauerstoffspezies (ROS)63
2.1.3.5 Multi-Spectral-Imaging (MSI)64
2.1.4 Neuronale Tracer und ihre Anwendungen (Neuronales Tracing)64
2.1.4.1 Retrograde und anterograde Tracer65
2.1.4.1.1 Retrograde Tracer65
2.1.4.1.2 Anterograde Tracer67
2.1.4.1.3 Tracer, die sowohl anterograd als auch retrograd laufen67
2.1.4.1.4 Lösen, Haltbarkeit und Lagerung der Tracersubstanzen67
2.1.4.1.5 Auswahl des Tracers für ein Experiment67
2.1.4.2 Allgemeiner Ablauf eines Versuchs67
2.1.4.3 Techniken zur Tracer-Applikation67
2.1.4.3.1 Kristalline Anwendung68
2.1.4.3.2 Druckapplikation68
2.1.4.3.3 Iontophoretische Injektion69
2.1.4.4 Perfusionskammer für in vitro-Farbstoffapplikationen71
2.1.4.5 Farbstoffapplikationen in der Interface-Kammer73
2.1.4.6 Anwendungsbeispiele für Tracer-Applikationen76
2.1.4.6.1 Fluoro Ruby (FR)76
2.1.4.6.2 Biotinylierte Dextranamine (BDA)79
2.1.4.6.3 Choleratoxin B (CtB)81
2.1.4.6.4 Phaseolus vulgaris Leucoagglutinin (PHA-L)83
2.1.4.6.5 Neurobiotin, Biocytin84
2.1.4.6.6 Carbocyanine (Lucifer Yellow, DiI, DiO, DiA)87
2.2 Probengewinnung zur mikroskopischen Untersuchung und Präparation88
2.2.1 Abstrichpräparate88
2.2.2 Ausstrichpräparate89
2.2.2.1 Ausstriche von Zellsuspensionen89
2.2.2.2 Organausstriche90
2.2.3 Tupf- oder Abklatschpräparate90
2.2.4 Isolationspräparate (Zupfpräparate)90
2.2.5 Isolation von Zellen90
2.2.5.1 Entnahme von adhärenten Zellenaus Zellkulturen90
2.2.5.2 Anreicherung von Suspensionszellen91
2.2.5.3 Zellsuspensionen von Epithelien91
2.2.5.4 Mazerationsmethoden von Zellverbänden92
2.2.6 Isolation von Gewebeteilen92
2.2.6.1 Biopsie93
2.2.6.2 Native Schnitte93
2.2.6.2.1 Freihandschnitte93
2.2.6.2.2 Herstellung von Schnitten mit Hilfe des Handmikrotoms93
2.2.6.2.3 Herstellung von Schnitten mit Hilfe des Vibratoms94
2.2.6.2.4 Herstellung von Schnitten mit Hilfe des Kryostaten95
2.2.7 Isolation von Zellkompartimenten und Organellen95
2.2.8 Trennen und Sortieren von Zellen95
2.2.8.1 Durchflusscytometrie95
2.2.8.2 Zelltrennung mit Hilfe paramagnetischer Kügelchen (beads)96
2.2.9 Lasermikrodissektion96
2.3 Fixierungen für Licht- und Elektronenmikroskopie98
2.3.1 Theorie der Fixierung98
2.3.1.1 Ziel der Fixierung98
2.3.1.2 Fixierungsverfahren99
2.3.1.3 Mechanismen der chemischen Fixierung100
2.3.2 Fixanzien für die Licht- und Elektronenmikroskopie100
2.3.2.1 Fixanzien für die Histologie100
2.3.2.1.1 Formalin und formalinhaltige Lösungen102
2.3.2.1.2 Ethanol und ethanolhaltige Lösungen102
2.3.2.1.3 Fixierung in kalten Lösungsmitteln103
2.3.2.1.4 Pikrinsäure und pikrinsäurehaltige Lösungen103
2.3.2.1.5 Quecksilberchlorid (Sublimat) und sublimathaltige Lösungen103
2.3.2.1.6 Die HOPE-Fixierung103
2.3.2.2 Gängige Fixanzien für die Elektronenmikroskopie107
2.3.2.2.1 Glutaraldehyd (GA)107
2.3.2.2.2 Formaldehyd (FA)109
2.3.2.2.3 Fixierungsgemische mit Glutaraldehyd und Formaldehyd109
2.3.2.2.4 Osmiumtetroxid109
2.3.2.3 Spezielle Fixierungen110
2.3.2.3.1 2-Phasen-Fixierung110
2.3.2.2.2 Alternative Fixanzien für die Immunmarkierung und Enzymlokalisation110
2.3.3 Fixierungsbedingungen und Anforderungen an die Präparate110
2.3.3.1 Präparatgröße und Penetration110
2.3.3.2 Menge und Konzentration des Fixans110
2.3.3.3 Dauer und Temperatur der Fixierung110
2.3.3.4 Osmolarität und Ionenzusammensetzung110
2.3.3.5 pH, Puffer und Pufferzusätze111
2.3.4 Praxis der Fixierung für die Lichtmikroskopie111
2.3.4.1 Fixierungsartefakte und Abhilfemöglichkeiten112
2.3.5 Praxis der Fixierung für die Elektronenmikroskopie112
2.3.6 Fixierungsartefakte und Abhilfemöglichkeiten113
2.3.7 Beispielhafte Anleitungen114
2.3.7.1 Behandlung von Zellen und Suspensionen114
2.3.7.2 Fixierungen für die Cytodiagnostik114
2.3.7.2.1 Trockenfixierung114
2.3.7.2.2 Feuchtfixierung114
2.3.7.2.3 Hitzefixierung (Fixierung vonBakterien)115
2.3.7.3 Fixierungen für die Elektronenmikroskopie115
2.3.7.3.1 Fixierungen von menschlichen oder tierischen Gewebeproben115
2.3.7.3.2 Fixierung von Pflanzenmaterial115
2.3.7.3.3 Fixierung von Meerwasserorganismen115
2.3.8 Aufbewahrung fixierten Materials115
2.3.9 Fixierungs- und Einbettautomaten115
2.4 Schnittpräparation116
2.4.1 Schnittpräparation für die Lichtmikroskopie116
2.4.1.1 Einbettung116
2.4.1.1.1 Allgemeines116
2.4.1.1.2 Auswaschen des Fixierungsmittels aus den Präparaten116
2.4.1.1.3 Entwässern der Präparate117
2.4.1.1.4 Einbringen der Präparate in ein Intermedium (Zwischenflüssigkeit)119
2.4.1.1.5 Durchtränken der Präparate mit dem Einbettmittel119
2.4.1.1.6 Ausgießen (in Blöcke gießen) der Präparate im Einbettmittel119
2.4.1.1.7 Aushärten der Blöcke121
2.4.1.2 Einbettzubehör121
2.4.1.2.1 Zubehör für die Einbettung von Hand121
2.4.1.2.2 Einbettautomaten121
2.4.1.2.3 Paraffinspender/Ausgießstation122
2.4.1.3 Einbettprotokolle122
2.4.1.3.1 Paraffineinbettung122
2.4.1.3.2 Kunststoffeinbettung126
2.4.1.3.3 Celloidineinbettung128
2.4.1.3.4 Einbettung in Celloidin-Paraffin131
2.4.1.3.5 Agareinbettung131
2.4.1.4 Mikrotome und Mikrotomie131
2.4.1.4.1 Allgemein131
2.4.1.4.2 Messer in der Paraffinmikrotomie132
2.4.1.4.3 Spezialmesser133
2.4.1.4.4 Stellung des Mikrotommessers beim Paraffinschneiden133
2.4.1.4.5 Mikrotomtypen134
2.4.1.4.6 Schneidetechnik am Mikrotom135
2.4.1.5 Leitfaden zur Beurteilung der Präparation136
2.4.1.5.1 Probleme und Artefakte bei der Schnittpräparation und ihre Abhilfe136
2.4.1.5.2 Beurteilung von Artefakten im Präparat136
2.4.2 Schnittpräparation für die Elektronenmikroskopie138
2.4.2.1 Entwässern und Einbetten für die Ultradünnschnitttechnik138
2.4.2.1.1 Waschen138
2.4.2.1.2 Entwässerung138
2.4.2.1.3 Einbettung von Gewebeproben139
2.4.2.1.4 Einbettung von Suspensionszellen, kleinen Gewebeteilen oder -schnitten142
2.4.2.1.5 Einbettung und Schnittvorbereitung von Aufwuchspräparaten143
2.4.2.1.6 Orientierte Einbettung, Umbettung und Umorientierung von Präparaten143
2.4.2.1.7 Umbettung von Paraffineinbettungen145
2.4.2.1.8 Häufige Probleme durch Fehler bei der Entwässerung und Einbettung und mögliche Abhilfe145
2.4.2.2 Ultramikrotomie146
2.4.2.2.1 Objektträgernetzchen (Grids)146
2.4.2.2.2 Glas- und Diamantmesser148
2.4.2.2.3 Trimmen148
2.4.2.2.4 Anfertigen und Auffangen der Schnitte149
2.4.2.2.5 Probleme bei der Ultramikrotomie und Möglichkeiten der Abhilfe152
2.5 Präparation für die konventionelle Rasterelektronenmikroskopie (REM)154
2.5.1 Präparate für die REM154
2.5.2 Präparationsschritte154
2.5.2.1 Reinigung154
2.5.2.2 Freilegen interner Strukturen155
2.5.2.3 Stabilisierungen155
2.5.2.4 Abdruckverfahren156
2.5.2.5 Trocknung156
2.5.2.5.1 Imprägnierung mit Glycerin156
2.5.2.5.2 Lufttrocknung156
2.5.2.5.3 Gefriertrocknung156
2.5.2.5.4 Kritische-Punkt-Trocknung156
2.5.2.6 Befestigen der Präparate157
2.5.2.7 Sputtern158
2.5.2.7.1 Prinzip des Sputterns158
2.5.2.7.2 Sputter-Coater158
2.5.2.7.3 Wahl des Target-Materials158
2.5.2.7.4 Schichtdicken159
2.5.2.8 Techniken für stark zerklüftete Objekte oder hohe Auflösung159
2.5.2.8.1 Imprägnierung mit OsO4159
2.5.2.8.2 Abdecken mit Aluminiumfolie159
2.5.2.9 Aufbewahrung der Präparate159
2.5.3 Artefakte159
2.6 Kontrastierungstechniken für die Transmissionselektronenmikroskopie (TEM)160
2.6.1 Einführung160
2.6.2 Negativkontrastierung160
2.6.2.1 Kontrastierungslösungen160
2.6.2.1.1 Phosphorwolframat (PW)160
2.6.2.1.2 Uranylacetat (UA)161
2.6.2.2 Vorgehensweise161
2.6.2.2.1 1-Schritt-Methode161
2.6.2.2.2 2-Schritt-Methode161
2.6.2.3 Probleme und Problemlösungen162
2.6.3 Bedampfung163
2.6.4 Positive Kontrastierungstechniken163
2.6.4.1 Generelle Kontrastierungen164
2.6.4.1.1 en bloc-Kontrastierung164
2.6.4.1.2 Schnittkontrastierung164
2.6.4.1.3 Schnittkontamination durch die Kontrastierung und mögliche Abhilfen165
2.6.4.2 Spezifische Nachweise165
2.6.4.2.1 Nachweis von Ionen165
2.6.4.2.2 Nachweis von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS)166
2.6.4.2.3 Nachweis von Zuckern166
2.7 Kryopräparation für die Licht- und Elektronenmikroskopie168
2.7.1 Kryopräparationstechniken für die Lichtmikroskopie168
2.7.1.1 Einfrieren der Probe168
2.7.1.1.1 Einfrieren mit Isopentan169
2.7.1.1.2 Einfrieren mit CO2169
2.7.1.1.3 Aufkleben und langsames Einfrieren169
2.7.1.2 Kryostatschnitte170
2.7.1.2.1 Herstellen von Kryostatschnitten170
2.7.2 Kryopräparationen für die Elektronenmikroskopie171
2.7.2.1 Kryofixierung171
2.7.2.1.1 Einfrieren bei Umgebungsdruck172
2.7.2.1.2 Einfrieren unter hohem Druck (Hochdruckgefrierfixierung)174
2.7.2.2 Entwässerung bei tiefen Temperaturen178
2.7.2.2.1 Entwässerung bei 0–4 °C178
2.7.2.2.2 Progressive lowering of temperature-(PLT-)Entwässerung179
2.7.2.2.3 Gefriersubstitution179
2.7.2.3 Gefrierbruch- und Replikatechnik180
2.7.2.3.1 Vorbereitung der Gefrierbrucheinrichtung180
2.7.2.3.2 Transfer der Probe in die Gefrierbruchanlage182
2.7.2.3.3 Gefrierbruch182
2.7.2.3.4 Gefrierätzung183
2.7.2.3.5 Replizieren der Bruchoberfläche183
2.7.2.3.6 Abschwimmen der Replika und Replikareinigung184
2.7.2.4 Kryoschneiden184
2.7.2.4.1 Kryoschneiden von gefriergeschützten Proben185
2.7.2.4.2 Kryoschneiden von nicht gefriergeschützten Proben185
2.8 Literatur185
3 Färbungen191
3.1 Allgemeines zur Färbung191
3.2 Farbstoffe191
3.2.1 Der sichtbare Anteil des Spektrums, Farben und Licht siehe Kapitel 1.1.2191
3.2.2 Klassifizierung von Farbstoffen191
3.2.3 Wichtige Farbstoffe192
3.2.4 Ladung der Farbstoffe192
3.2.5 Kennzeichnung von Farbstoffen194
3.2.6 Färbevokabular194
3.2.7 Färbetheorien195
3.2.7.1 Chemische Färbungen196
3.2.7.2 Physikalische Färbungen196
3.2.7.3 Physiko-chemische Färbungen196
3.2.7.4 Theorie der indirekten Färbungen (Beizen)196
3.3 Herstellen der Farblösungen197
3.4 Färbezubehör197
3.4.1 Färbeküvetten197
3.4.2 Färbebänke, Tropfflaschen und sonstiges Zubehör197
3.4.3 Färbeautomaten198
3.4.3.1 Färbeautomat „Karussell“198
3.4.3.2 Linearfärbeautomat198
3.4.3.3 programmierbarer Universalfärbeautomat198
3.5 Behandlung der Schnitte vor und nach dem Färben199
3.5.1 Montage der Schnitte auf Objektträger und Trocknung199
3.5.1.1 Objektträger199
3.5.1.2 Schnittmontage und Trocknung199
3.5.1.3 Beschichtungsmöglichkeiten der Objektträger200
3.5.1.3.1 Eiweißglycerin200
3.5.1.3.2 Chromalaungelatine200
3.5.1.3.3 Poly-L-Lysin200
3.5.1.3.4 Silanisierung201
3.5.2 Behandlung der Schnitte unmittelbar vor der Färbung201
3.5.2.1 Paraffinschnitte201
3.5.2.2 Gefrierschnitte201
3.5.2.3 Kunststoffschnitte201
3.5.2.4 Fixierungsniederschläge und deren Entfernung202
3.5.3 Behandlung der Schnitte nach der Färbung203
3.5.3.1 Nachbehandlung und Fixieren der Färbung203
3.5.3.2 Einschließen der Präparate203
3.5.3.2.1 Einschlussmittel für wasserfreie Präparate204
3.5.3.2.2 Einschlussmittel für wasserhaltige Präparate205
3.5.3.2.3 Umranden der Präparate207
3.5.3.3 Erneutes Eindecken/Reparatur207
3.5.3.4 Behandlung verblasster Präparate207
3.6 Färbemethoden208
3.6.1 Kernfarbstoffe und Kernfärbungen209
3.6.1.1 Hämatoxylin209
3.6.1.1.1 Hämatoxylin und Hämatein209
3.6.1.2 Hämatoxylinlacke209
3.6.1.3 Hämalaune209
3.6.1.3.1 Saures Hämalaun n. Mayer (1920)210
3.6.1.3.2 Hämalaun n. Harris (1900)211
3.6.1.3.3 Hämalaun n. Delafield (1885)211
3.6.1.3.4 Saures Hämalaun n. Ehrlich (1886)212
3.6.1.4 Färben mit Hämalaunlösungen212
3.6.1.5 Eisenhämatoxyline213
3.6.1.6 Weitere Kernfärbungen214
3.6.2 Cytoplasmafarbstoffe und Cytoplasmafärbungen215
3.6.3 Fluoreszenzfarbstoffe217
3.6.3.1 Acridinorange217
3.6.3.2 Coriphosphin O217
3.6.3.3 Auramin-Rhodamin217
3.6.4 Pigmente217
3.6.4.1 Allgemeines217
3.6.4.2 Löslichkeit der Pigmente in Säuren und Laugen218
3.6.4.3 Bleichen der Pigmente mit H2O2218
3.6.4.4 Nachweis/Verhalten einzelner Pigmente219
3.6.4.4.1 Argentaffine Reaktion219
3.6.4.4.2 Hämosiderin (Siderin)220
3.6.4.4.3 Hämatoidin220
3.6.4.4.4 Malariapigment220
3.6.4.4.5 Lipofuszin (Chromolipoid)220
3.6.4.4.6 Melanin220
3.6.4.4.7 Exogene Pigmente220
3.6.5 Basophilie220
3.6.6 Metachromasie221
3.6.7 Übersichtsfärbungen223
3.6.8 Schnellfärbungen225
3.6.9 Bindegewebsfärbungen225
3.6.9.1 Trichromfärbungen225
3.6.9.2 Darstellung von elastischen Bindegewebsfasern229
3.6.9.2.1 Komponenten des elastischen Fasersystems229
3.6.9.2.2 Färbung von Mikrofibrillen der elastischen Fasern und Oxytalanfasern230
3.6.9.3 Darstellung von retikulären Bindegewebsfasern233
3.6.10 Stoffnachweise236
3.6.10.1 Kohlenhydrate236
3.6.10.1.1 Alcianblaufärbungen238
3.6.10.1.2 Enzymverdauung240
3.6.10.1.3 Glykogen241
3.6.10.1.4 Nachweis von Kohlenhydraten und Glykokonjugaten mit Hilfe von Lektinen243
3.6.10.2 Amyloid245
3.6.10.3 Fibrin247
3.6.10.4 Lipide247
3.6.10.5 Eisen249
3.6.10.6 Calciumsalze (Kalk)251
3.6.10.7 Proteine252
3.6.11 Nachweis von DNA (Desoxyribonucleinsäure)252
3.6.12 Darstellung von Bakterien, Pilzen, und Protozoen im histologischen Schnitt253
3.6.13 Darstellung von Blutzellen im histologischen Schnitt258
3.6.14 Darstellung des Nervengewebes260
3.6.14.1 Färbung von Kern- und Nissl-Substanz260
3.6.14.2 Darstellung von Nerven- und Gliazellen einschließlich ihrer Fortsätze261
3.6.14.3 Darstellung von Neurofibrillen mit Silberimprägnationsverfahren266
3.6.14.4 Darstellung der Markscheiden (Myelinscheiden)270
3.6.14.5 Darstellung degenerierender markhaltiger Nervenfasern274
3.6.14.6 Darstellung peripherer markhaltiger Nervenfasern275
3.6.14.6.1 Osmierung275
3.6.14.6.2 Darstellung der Axone peripherer Nerven276
3.6.14.7 Darstellung von Gliazellen276
3.6.14.8 Immunhistologische Nachweise des Nervengewebes277
3.6.15 Färbungen an Kunststoffschnitten277
3.6.15.1 Allgemeines277
3.6.15.2 Entfernen des Kunststoffs (entplasten) aus dem Gewebeschnitt278
3.6.15.3 Färben ohne Entfernen des Kunststoffs aus dem Schnitt278
3.6.16 Stückfärbung279
3.6.17 Medizinische Cytodiagnostik280
3.6.17.1 Allgemeines und Zellentnahmeverfahren280
3.6.17.2 Präparateherstellung281
3.6.17.2.1 Abstrichpräparate von Schleimhäuten281
3.6.17.2.2 Tupfpräparate281
3.6.17.2.3 Organausstriche281
3.6.17.2.4 Blutausstriche281
3.6.17.2.5 Ausstriche von Flüssigkeiten oder Sekreten282
3.6.17.2.6 Knochenmarkausstriche/ Quetschpräparate282
3.6.17.2.7 Ausstriche von Feinnadelaspirationsmaterial282
3.6.17.3 Fixierung282
3.6.17.3.1 Trockenfixierung283
3.6.17.3.2 Feuchtfixierung283
3.6.17.3.3 Hitzefixierung (Fixierung vonBakterien)283
3.6.17.4 Färbemethoden283
3.6.17.4.1 Alternative Färbemethoden286
3.7 Artefakte291
3.8 Herstellen mikroskopischer Injektions- und Korrosionspräparate292
3.8.1 Injektionspräparate292
3.8.1.1 Tuscheinjektion292
3.8.1.2 Gelatineinjektionen292
3.8.1.3 Kautschukinjektion294
3.8.2 Korrosionspräparate294
3.9 Einsatz der Polarisationsmikroskopie für die medizinische Diagnostik296
3.9.1 Grundlagen der Polarisationsmikroskopie297
3.9.2 Topo-optische Reaktionen298
3.9.2.1 Die Bedeutung der durch Kongorotfärbung verursachten Anisotropie in der Histologie298
3.9.2.2 Metachromasie als inverse topo-optische Färbungsreaktion (Toluidinblau-Präzipitations-Methode nach Romhányi 1963)299
3.9.2.3 Aldehyd-Bisulfit -Toluidinblau-(ABT)-Rektion, Permanganat-Toluidin-blau- (PBT)-Reaktion und Sialinsäurespezifische topo-optische Reaktion301
3.10 Literatur303
4 Präparationstechniken und Färbungen von speziellen Geweben308
4.1 Präparation spezieller Gewebe308
4.1.1 Paraffineinbettung von großen Objekten308
4.1.2 Bearbeitung (Fixierung, Einbettung und z.T. Färbung) spezieller Organe309
4.1.2.1 Zentralnervensystem309
4.1.2.2 Sinnesorgane310
4.1.2.2.3 Geruchrorgan312
4.1.2.3 Respirationstrakt312
4.1.2.4 Haut313
4.1.2.4.1 Epidermis313
4.1.2.4.2 Spezielle harte Differenzierungen der Epidermis313
4.1.2.5 Geschlechtsorgane314
4.1.2.5.1 Weibliche Geschlechtsorgane, Eizellen314
4.1.2.5.2 Männliche Geschlechtsorgane, Spermien314
4.1.2.6 Embryologische Präparate316
4.1.2.6.1 Vögel316
4.1.2.6.2 Säugetiere317
4.1.2.6.3 Säugetiere: Präparieren jüngster Entwicklungsstadien318
4.1.2.6.4 Säugetiere: Präparieren älterer Entwicklungsstadien318
4.2 Präparation von Hartgewebe für die Histologie318
4.2.1 Allgemeines318
4.2.2 Präparationsmöglichkeiten319
4.2.3 Fixierung von Hartgewebe319
4.2.3.1 Allgemeines319
4.2.3.2 Fixierflüssigkeiten im Detail320
4.2.3.2.1 Ethanol320
4.2.3.2.2 Formollösungen320
4.2.3.2.3 Formol-Alkohol-Gemische320
4.2.4 Entkalkung320
4.2.4.1 Entkalkungsprinzipien321
4.2.4.1.1 Entkalkungstechnik321
4.2.4.2 Entkalkungszeit321
4.2.4.3 Beschleunigungsverfahren322
4.2.4.3.1 Ultraschallentkalkung322
4.2.4.3.2 Elektrolytische Entkalkung322
4.2.4.4 Entkalkungsnachbehandlung322
4.2.4.5 Entkalkungsmedien322
4.2.4.5.1 Salpetersäure322
4.2.4.5.2 Trichloressigsäure323
4.2.4.5.3 Ameisensäure323
4.2.4.5.4 Pikrinsäure323
4.2.4.5.5 Zitronensäure323
4.2.4.5.6 Ethylen-Diamin-Tetra-Acetat (EDTA)323
4.2.4.5.7 Schnellentkalkungsmedien323
4.2.5 Kunststoffeinbettung323
4.2.5.1 Allgemeines323
4.2.5.2 Trenn-Dünnschnitt-Technik324
4.2.5.3 Trenn-Dünnschliff-Technik324
4.2.5.4 Darstellungstechniken für Trenn-Dünnschnitte oder Trenn-Dünnschliffe324
4.2.6 Schliffherstellung ohne Vorbehandlung324
4.2.6.1 Handschleiftechnik324
4.2.6.2 Maschinelle Schleiftechnik325
4.2.7 Mazeration von Skelettteilen325
4.3 Literatur325
5 Präparationstechniken und Färbungen von Pflanzengewebefür die Lichtmikroskopie326
5.1 Einführung326
5.2 Mikroskopische Technik = Mikrotechnik326
5.2.1 Vorbereitung des Untersuchungsmaterials326
5.2.2 Wahl des Präparates326
5.2.3 Fixierung327
5.2.3.1 Zustand des zu fixierenden Objektes327
5.2.3.2 Objektgröße327
5.2.3.3 Lufthaltige Objekte327
5.2.3.4 Objekte mit schlecht benetzbaren Oberflächen328
5.2.3.5 Dauer der Fixierung328
5.2.4 Fixierflüssigkeiten328
5.2.4.1 Ethanol328
5.2.4.2 Formol328
5.2.4.3 Ethanol-Eisessig-Gemische328
5.2.4.4 Alkohol-Formalin-Eisessig (AFE)329
5.3 Weiterverarbeitung des fixierten Materials329
5.3.1 Konservierung329
5.3.1.1 Konservierungsgemisch nach Strasburger329
5.3.2 Mazeration329
5.3.2.1 Natürliche Mazeration329
5.3.2.2 Physikalische und chemische Mazeration329
5.4 Herstellen von lichtmikroskopischen Präparaten330
5.4.1 Basismaterialien zur Herstellung mikroskopischer Präparate330
5.4.2 Schnitttechnik330
5.4.2.1 Handschnitte330
5.4.2.2 Handmikrotome331
5.4.2.3 Schlittenmikrotome331
5.4.3 Weiterverarbeitung des Schnittes zu einem lichtmikroskopischen Präparat332
5.4.3.1 Aufhellung des Präparates332
5.4.3.2 Färbemethoden332
5.4.3.3 Färbung der Präparate333
5.5 Ausgewählte Färbevorschriften333
5.6 Hämatoxylinlösungen339
5.7 Einschlussmittel für Dauerpräparate345
5.7.1 Wasserlösliche Einschlussmedien345
5.7.1.1 Glycerin345
5.7.1.2 Glyceringelatine345
5.7.1.3 Hydromatrix345
5.7.2 Wasserunlösliche Einschlussmittel346
5.7.2.1 Euparal346
5.7.2.2 Eukitt346
5.7.2.3 Malinol346
5.8 Literatur346
6 Präparationstechniken und Färbungen von Protozoen und Wirbellosen für die Lichtmikroskopie348
6.1 Einführung348
6.2 Besonderheiten der Untersuchung348
6.2.1 Bedeutung der Lebendbeobachtung351
6.2.2 Herabsetzen der Beweglichkeit von Mikroorganismen351
6.2.3 Vital- und Supravitalfärbungen351
6.2.4 Betäubung352
6.2.5 Vorfixierung („Räucherungsmethoden“)352
6.2.6 Fixieren356
6.2.7 Vorbehandlung von Weich-und Hartsubstanzen359
6.2.8 Bemerkungen zu den Organismengruppen360
6.2.8.1 Protozoen, heterotrophe eukaryotische Einzeller360
6.2.8.2 Evertebrata, Wirbellose364
6.3 Literatur369
7 Cytogenetik371
7.1 Allgemeines371
7.2 Chromosomenspreitung372
7.3 Chromosomenfärbungen372
7.3.1 Färbung mit Milchsäure-Orcein372
7.3.2 Q-Bänderung mit Quinacrin373
7.3.3 Q-Bänderung mit Hoechst 33258373
7.3.4 Distamycin A/DAPI-(DA/DAPI-) Färbung374
7.3.5 C-Bänderung mit Giemsa-Färbung374
7.3.6 G-Bänderung mit Giemsa-Färbung374
7.4 Fluorochromierung375
7.5 Histonnachweis375
7.5.1 Fast Green FCF für Histone375
7.5.2 Dansylchlorid375
7.6 Extraktionsmethoden für Nucleinsäuren376
7.6.1 Säureextraktion376
7.6.1.1 Perchlorsäure (HCIO4)376
7.6.1.2 Trichloressigsäure 5–10 % (CCl3 COOH)376
7.6.1.3 Pikrinsäure376
7.6.2 Enzymatische Extraktion376
7.7 Literatur376
8 Enzymhistochemie378
8.1 Allgemeines378
8.1.1 Gewebevorbehandlung378
8.1.1.1 Fixierung378
8.1.1.2 Einfrieren von Gewebe, Kryostatschnitte (Kap. 2.7.1)379
8.1.1.3 Inkubationsmedien379
8.2 Ausgewählte Methoden von Enzymnachweisen380
8.2.1 Phosphatasen380
8.2.1.1 Alkalische Phosphatase380
8.2.1.2 Saure Phosphatase382
8.2.1.3 Glukose-6-Phosphatase383
8.2.1.4 Adenosintriphosphatasen (ATPasen)384
8.2.2 Carboxylesterhydrolasen385
8.2.2.1 Unspezifische Esterasen385
8.2.2.2 Cholinesterasen385
8.2.3 Oxidasen, Peroxidasen387
8.2.3.1 Cytochrom-C-Oxidase387
8.2.3.2 Peroxidase387
8.2.3.3 Katalase388
8.2.4 Dehydrogenasen389
8.2.4.1 Bernsteinsäuredehydrogenase (Succinatdehydrogenase)389
8.2.4.2 Tetrazoliumreduktasen390
8.2.5 Transferasen390
8.2.5.1 Glykogenphosphorylase (nach C. Sewry)390
8.2.6 Lyasen391
8.2.6.1 Carboanhydrase (Carbonat-Dehydratase)391
8.3 Literatur392
9 Immunlokalisation393
9.1 Einführung393
9.1.1 Grundlagen393
9.1.2 Aufbau und Eigenschaften von Antikörpern394
9.1.3 Ähnliche Nachweissysteme394
9.2 Herkunft, Auswahl, Überprüfung und Reinigung von Antikörpern395
9.2.1 Herstellung von Antikörpern395
9.2.2 Reinigung von Antikörpern398
9.3 Nachweismethoden und Detektion399
9.3.1 Direkte und indirekte Immunmarkierung399
9.3.2 Auswahl der Antikörper400
9.3.3 Indirekte Immunmarkierung über Protein A400
9.3.4 Signalverstärkung durch die (Strept-)Avidin-Biotin-(ABC-)Technik401
9.3.5 Lokalisation mehrerer Antigene401
9.3.6 Detektion402
9.3.7 Signalverstärkung durch Enzym-Anti-Enzym-Komplex-Techniken407
9.3.8 Tyraminkatalysierte Signalverstärkung407
9.4 Anforderungen an die Präparate408
9.4.1 Whole mount-Immunmarkierung und preembedding-Verfahren408
9.4.2 Markierung an Schnitten408
9.4.3 Durchführung der Immunmarkierung409
9.5 Kontrollen und Problembehandlung412
9.5.1 Antigendemaskierung412
9.5.2 Blockierung von Aldehydgruppen414
9.5.3 Verminderung der Autofluoreszenz414
9.6 Ausgewählte Anleitungen415
9.6.1 Affinitätsreinigung von Antikörpern415
9.6.2 Antigendemaskierung416
9.6.2.1 Wiederherstellung der Antigenität von Schnittpräparaten für die Lichtmikroskopie nach Fixierung in Formaldehyd und Paraffineinbettung416
9.6.2.2 Antigendemaskierung für die Immunelektronenmikroskopie417
9.6.3 Immunhistologische Markierungen418
9.6.4 Immunmarkierungen für die Elektronenmikroskopie419
9.6.5 Immunmarkierungen für Licht- und Elektronenmikroskopie419
9.6.6 Silberverstärkung420
9.6.7 Reduktion der Autofluoreszenz420
9.6.8 Herstellung von Einbettmedien für Fluoreszenzpräparate421
9.7 Literatur422
10 in situ-Hybridisierung424
10.1 Einleitung424
10.1.1 Prinzip424
10.1.2 DNA:DNA-in-situ-Hybridisierung425
10.1.3 RNA:RNA-in situ-Hybridisierung427
10.2 Sonden428
10.2.1 DNA-Sonden428
10.2.2 RNA-Sonden429
10.2.3 Sonden für Bakterien- oder Virussequenzen430
10.3 Markierung der Sonden430
10.4 Anforderungen an die Präparate431
10.5 Präparation von Chromosomen und Zellkernen431
10.6 Vorbehandlung der Präparate432
10.7 Denaturierung der Nucleinsäuren432
10.8 Hybridisierung432
10.8.1 Spezifität der Hybridisierung432
10.8.2 Stringenz433
10.8.3 Verminderung von unspezifischer Hintergrundmarkierung433
10.8.4 Hybridisierungskinetik433
10.8.5 Kontrollen434
10.9 Laborausstattung und Reagenzien434
10.9.1 Ausstattung434
10.9.2 Reagenzienqualität und- Handhabung435
10.10 Arbeitsvorschriften435
10.11 Probleme und Fehlerquellen450
10.12 Literatur452
11 Tissue-Printing454
11.1 Einführung454
11.2 Generelle Methodik des Tissue-Printing (geeignet für festes Pflanzengewebe)454
11.3 Tissue-Prints von zartem Gewebe mit Hilfe von Kryostatschnitten456
11.4 Nachweise an Tissue-Prints456
11.4.2 Western-Tissue-Print457
11.4.3 Northern-Tissue-Print458
11.4.4 Lokalisation von Enzymaktivität am Tissue-Print459
11.5 Literatur460
12 Reporterproteine461
12.1 Einleitung461
12.1.1 Enzymatische und lichterzeugende Reporter461
12.1.2 Chemilumineszenz oder Fluoreszenz?463
12.1.3 Zur Geschichte der FP463
12.1.4 Grundlegendes zu fluoreszierenden Proteinen464
12.2 Fluoreszierende Reporter in der Anwendung467
12.2.1 Konstruktion geeigneter Expressionsvektoren467
12.2.1.1 Die Wahl des geeigneten Reportergens467
12.2.1.2 Wichtige cis-Elemente: Promotoren und Enhancer467
12.2.1.3 Vektoren für die lokalisierte FP-Expression468
12.2.2 Transiente und stabile Genexpression468
12.2.3 Fluoreszenzmikroskopie Analyse470
12.3 Literatur472
13 Qualitative und Quantitative Analyse in der Mikroskopie473
13.1 Einleitung473
13.2 Erstellung mikroskopischer Bilder473
13.2.1 Digitale Kameras473
13.2.2 Erstellung der Helligkeitswerte aus einem mikroskopischen Bild474
13.2.3 Das Nyquisttheorem475
13.2.4 Verwendung des adäquaten Kameraadapters476
13.2.5 Kalibrierung476
13.2.6 Bildformate und Komprimierung477
13.3 Bildanalyse478
13.3.1 Konventionelle Verfahren zur Bildanalyse478
13.3.1.1 Verwendung eines Okularmikrometers478
13.3.1.2 Verwendung einer Zählkammer478
13.3.1.3 Stereologische Messungen480
13.3.2 Digitale Analyse480
13.3.2.1 Manuelle digitale Messungen480
13.3.2.2 Automatisierte Messungen480
13.3.2.3 Spezielle Verfahren in der digitalen Mikroskopie480
13.3.2.3.1 Aufnahmen von Panoramabildern480
13.3.2.3.2 Extended Depth of Focus (EDF)480
13.3.2.3.3 Dekonvolution482
13.4 Automatisierte Experimentdurchführung mit motorisierten Mikroskopen482
13.4.1 Motorische Komponenten482
13.4.2 Mehrdimensionale Mikroskopie483
13.4.3 Lebendzellmikroskopie484
13.5 Ausgewählte Verfahren in der modernen Fluoreszenzmikroskopie484
13.5.1 Quantifizierung von Fluoreszenzsignalen484
13.5.1.1 Aufnahme fluoreszenzmikroskopischer Bilder484
13.5.1.2 Korrekturmechanismen nach der Bildaufnahme485
13.5.2 Co-Lokalisation486
13.5.3 Untersuchung der Proteindynamik in lebenden Zellen mit Hilfe fluoreszierender Proteine486
13.5.4 FRET488
13.5.5 Quantitative und qualitative Analyse des Fluoreszenzspektrums490
13.5.6 Quantitative Analyse von Ionenkonzentrationen/Ratio Imaging491
13.6 Bezugs- und Informationsquellen für Software und Analysemodule492
13.7 Literatur493
14 Arbeitsschutz und Sicherheit im histologischen Labor494
14.1 Einführung494
14.2 Allgemeines und Grundsätzliches494
14.3 Sicherheitstechnische Laborausstattung495
14.4 Notfalleinrichtungen495
14.5 Persönliche Schutzausrüstung495
14.6 Hautschutz/Hautschutzplan496
14.7 Umgang mit Untersuchungsmaterial496
14.8 Desinfektion496
14.9 Gefahrstoffe496
14.9.1 Kennzeichnung von Gefahrstoffen496
14.9.2 Aufbewahrung, Umgang und Transport von Gefahrstoffen496
14.9.3 Aufnahmewege von Gefahrstoffen499
14.9.4 Freisetzung von Gefahrstoffen499
14.9.5 Gefahrstoffverzeichnis499
14.9.6 Sicherheitsdatenblätter499
14.9.7 Betriebsanweisung499
14.9.8 Unterweisung501
14.10 Umgang mit Laborabfällen501
14.11 Umgang mit Mikrotommessern501
14.12 Brandschutz501
14.13 Infos zum Arbeitsschutz502
14.14 Literatur502
Anhang 1 Tabellen503
Anhang 2 Aktuelle Bücher zur Mikroskopie521
Anhang 3 Liste der Anleitungen524
Index531

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