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E-Book

Untersuchungen zur Struktur und Funktion der Transportdomänen des Autodisplay Systems

AutorElisa Winterer
VerlagCuvillier Verlag
Erscheinungsjahr2010
Seitenanzahl172 Seiten
ISBN9783736932487
FormatPDF
KopierschutzWasserzeichen
GerätePC/MAC/eReader/Tablet
Preis18,90 EUR
Mit Autodisplay steht ein System zur Verfügung, das die Präsentation eines funktionellen Passagierproteins auf der Oberfläche von E. coli Zellen ermöglicht. Im Rahmen dieser Arbeit wurde die carboxyterminale Aminosäure (Phenylalanin) der ß-Fass-Domäne des Autodisplay-Systems ausgetauscht. Sie wurde mit Hilfe der ortsgerichteten Mutagenese durch Tryptophan, Tyrosin, Histidin oder Valin ersetzt oder vollständig deletiert. Aromatische Aminosäuren konnten ohne Funktionsverlust gegeneinander getauscht werden. Durch Untersuchungen an der Valin-Mutante (hydrophob, aber nicht aromatisch) wurde nachgewiesen, dass die Integration oder der Transport, aber nicht die Konformation des Proteins beeinträchtigt war. Wurde die C-terminale Aminosäure deletiert, konnte kein außenmembranständiges Protein detektiert werden. Damit konnte ein direkter Einfluss der Aromatizität des C-Terminus auf die Integration in die äußere Membran nachgewiesen werden. Im Laufe der Zeit kam es durch Evolution und Selektion zu sieben Aminosäureaustauschen in den Transportdomänen. Die Mutationen hatten keinen Einfluss auf die in dieser Arbeit untersuchten Eigenschaften des Autodisplay, wie beispielsweise die Menge an oberflächenständigem Passagier. Durch Überexpression entstanden zwei unterschiedliche Proteinformen. Nur eine Form zeigte das für ß-Fass Proteine typische Verhalten der Hitzedenaturierung und präsentierte ihre Passa-gierdomäne auf der Oberfläche. Die andere Form befand sich in einer nicht funktionellen Konformation und transportierte den Passagier nicht über die äußere Membran. Durch eine Analyse der N-terminalen Proteinsequenz wurde nachgewiesen, dass nur das funktionelle Protein durch die Signalpeptidase prozessiert worden war. Durch Solubilisierung im Detergenz N-Lauryl-Sarcosinat-Natrium gelang es, die beiden Formen voneinander zu trennen. Das funktionelle Protein verhielt sich dabei genau wie das als Indikatorprotein dienende natürliche Außenmembranprotein OmpA, das ebenfalls ein ß-Fass ausbildet. Die Proteinexpression konnte durch Änderung der Induktionsbedingungen soweit optimiert werden, dass nur noch die funktionelle Variante gebildet wurde und ohne dass die Faltung der Struktur oder die Zahl der oberflächenständigen Passagiermoleküle beeinträchtigt war. Durch die Koexpression der periplasmatischen Chaperone SurA, FkpA, DsbA und DsbC konnte die Menge an oberflächenständigem Protein verdoppelt werden.

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