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E-Book

Zell- und Gewebekultur

AutorToni Lindl
VerlagSpektrum Akademischer Verlag
Erscheinungsjahr2002
Seitenanzahl329 Seiten
ISBN9783827411945
FormatPDF
KopierschutzDRM
GerätePC/MAC/eReader/Tablet
Preis38,00 EUR

"Dieses Methodenbuch zur Zell- und Gewebekultur soll Biologen, Medizinern, Pharmazeuten, Biotechnologen und technischen Assistenten die tägliche Laborroutine erleichtern. Neben der Vermittlung wissenschaftlicher Grundlagen und gesetzlicher Richtlinien sind es vor allem die leicht nachvollziehbaren ""Man-nehme""-Vorschriften, die den praktischen Wert des Buches ausmachen. Exemplarisch werden die wichtigsten Grundoperationen in der Zellkultur behandelt, so dass auch weniger mit der Kultur tierischer und pflanzlicher Zellen Vertraute sich gut mithilfe des Buches einarbeiten können. Der Info-Anhang enthält stöchiometrische Rechenbeispiele, ein umfangreiches Glossar, weiterführende Literaturhinweise und Adressen von Lieferfirmen mit Internetadressen.

In der 5. aktualisierten Auflage sind moderne Ansätze in der dreidimensionalen Zellkultur und in der Stammzellforschung hinzugekommen. Als sehr hilfreich werden sich die erweiterten Tipps und Lösungsvorschläge zum ""Trouble Shooting"" erweisen, sie stehen jetzt - extra gekennzeichnet - in direktem Zusammenhang bei den jeweiligen Methoden bzw. Themen.

Außerdem enthält diese Auflage erstmals Vorschriften zum Toxizitätsscreening embryonaler Stammzelllinen der Maus samt Differenzierungsansätzen hierfür. Sie sind zur Unterstützung der ""good cell culture practice"" in Form einer so genannten SOP (""standard operation procedures"") gehalten. Hierbei geht es um die verlässliche Nachvollziehbarkeit von Methoden und Ergebnissen, was für die Praxis der Zellkultur ein besonderes Anliegen dieses Buches ist.

Der Autor

Prof. Dr. Toni Lindl ist Dozent an der TU München (Weihenstephan) und Inhaber der Firma ""Institut für angewandte Zellkultur""."  

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Leseprobe

1.3 Der Sterilbereich (S. 3-4)

Dieser Bereich, in dem die eigentlichen Arbeiten an den Zellkulturen durchgeführt werden, ist so sparsam wie möglich auszustatten, um nicht unnötigerweise Platz und Ecken für Kontaminationsmöglichkeiten zu schaffen. Hier sollten nur die sterile Werkbank, der Brutschrank, ein Wasserbad, eine Zentrifuge, ein Umkehrmikroskop und Schränke für die Aufbewahrung von sterilen Gebrauchsgegenständen vorhanden sein. Dazu kommen allgemeine Einrichtungen wie Waschbecken, Gasanschluss und ausreichende Beleuchtung.

1.3.1 Die sterile Werkbank

Die sterile Werkbank, auch Reinraumwerkbank oder Sicherheitswerkbank genannt, ist in dem Sterilbereich möglichst weit entfernt von der Tür aufzustellen. Eine solche Werkbank ist heute eine unbedingte Voraussetzungen zur erfolgreichen Zellzüchtung. Alle anderen Lösungen, wie Arbeiten im Abzug mit UV-Lampe u.Ä. sind unzureichend und schützen nicht zuverlässig vor Kontaminationen. Es gibt eine Vielzahl von Modellen verschiedener Firmen, die aber prinzipiell zwei Typen zuzuordnen sind: Bei der sterilen Werkbank mit horizontaler Luftströmung wird die Luft in der Regel zunächst durch ein Hochleistungsschwebstofffilter (HOSCH-Filter, s. u.) gedrückt, das senkrecht an der Rückwand des Geräts montiert ist, und dann als sterile laminare Verdrängungsströmung horizontal über die Arbeitsfläche geführt (Abb. 1-3).

Diese Geräte sind keine Sicherheitswerkbänke im Sinne der DIN-Norm 12950: „Sicherheitswerkbänke für mikrobiologische und biotechnologische Arbeiten"". Sie dürfen daher für Arbeiten mit Gefährdungspotenzial nicht verwendet werden. Sie sind jedoch für Arbeiten ohne Gefährdungspotenzial durchaus geeignet, z.B. für sterile Präparationen unter einem Stereomikroskop, bei denen es zweckmäßig ist, wenn der Luftstrom herabfallende Partikel vom Präparat wegbläst. Diese Typenklasse ist auch geeignet für die Sterilfiltration ungefährlicher bzw. biologisch unbedenklicher Lösungen und Zubereitungen, wie Zellkulturmedien oder Serumfiltrationen. Die Werkbände sind einfach gebaut, wartungsarm und preisgünstig. Länger dauernde Arbeiten sind meistens unangenehm, weil dem Experimentator ständig Luft ins Gesicht bläst.

Bei der Reinraumwerkbank (Sicherheitswerkbank) mit vertikaler Strömung – zu diesem Typ gehören alle Sicherheitswerkbänke nach DIN 12 950 – wird die Luft entweder vertikal nach oben (Klasse 1) oder vertikal nach unten (Klasse 2) geleitet. Bei der Klasse 1 (Abb. 1-4a) wird die Raumluft ohne Filterung angesaugt und durch ein HOSCH-Filter nach oben in den Raum entlassen. Für steriles Arbeiten sind solche Werkbänke nicht geeignet."

Blick ins Buch
Inhaltsverzeichnis
Vorwort zur 5. Auflage8
Inhalt10
1 Räumliche und apparative Voraussetzungen, Sicherheitsvorschriften14
1.1 Der Reinigungsbereich14
1.2 Der Vorbereitungs- und Verarbeitungsbereich15
1.3 Der Sterilbereich16
1.4 Sicherheitsvorschriften und Entsorgung30
1.5 Generelle Probleme33
1.6 Literatur34
2 Kulturgefäße und ihre Behandlung36
2.1 Züchtung von Zellen auf Glas36
2.2 Züchtung von Zellen auf Plastikmaterial37
2.3 Züchtung von Zellen auf anderen Materialien41
2.4 Spezielle Kulturgefäße42
2.5 Reinigung und Vorbehandlung von Glaswaren46
2.6 Vorbehandlung von Kulturgefäßen mit Substanzen zur Modifizierung der Oberflächeneigenschaften50
3 Steriltechnik – Kontaminationen54
3.1 Der Sterilbereich55
3.2 Laborreinigung56
3.3 Hygiene56
3.4 Aseptische Arbeitstechnik56
3.5 Sterilisationsverfahren61
3.6 Antibiotika71
3.7 Mycoplasmen74
3.8 Kreuzkontaminationen84
3.9 Literatur85
4 Zellkulturmedien86
4.1 Herstellung gebrauchsfertiger Medien86
4.2 Anmerkungen zu einigen Rezepturen90
4.3 Serumfreie Medien94
4.4 Zusätze zu Medien102
4.5 Reinstwasser für Zell- und Gewebekulturen108
4.6 Literatur112
5 Routinemethoden zur allgemeinen Handhabung und Subkultivierung von Zellen114
5.1 Mediumwechsel114
5.2 Subkultivierung von Monolayerkulturen117
5.3 Subkultivierung und Suspensionskulturen122
5.4 Zellzahlbestimmung123
5.5 Langzeitlagerung und Kryokonservierung von Zellen128
5.6 Versand von Zellen133
5.7 Probleme mit Zellen133
5.8 Literatur134
6 Primärkulturen135
6.1 Kultivierung von Herzmuskelzellen des Hühnchens136
6.2 Kultivierung von Herzmuskelzellen aus neonatalen Rattenherzen138
6.3 Primärkulturen aus frischen Hautproben (Biopsien) menschlichen Ursprungs139
6.4 Isolierung von Lymphocyten aus Vollblut mittels Dichtegradientenzentrifugation140
6.5 Primärkulturen aus Mäusecerebellum (Kleinhirn)142
a142
c142
6.6 Gewinnung einer Zellkultur aus soliden Humantumoren144
6.7 Gewinnung von Keratinocyten146
6.8 Humane adhärente Zelllinien150
6.9 Literatur150
7 Organkulturen153
7.1 Präparation eines Säugerdünndarms als Beispiel für eine Organpräparation in der Pharmakologie156
7.2 Präparation eines peripheren Nerven (oberes Halsganglion) zur Messung der neuronalen Übertragung ( Neurotransmission)158
7.3 Leberschnitte in vitro160
7.4 Literatur163
8 Kultur spezieller Zelltypen164
8.1 Hybridomzellen164
8.1.1 Prinzipieller Verfahrensablauf164
8.1.2 Antigene und Adjuvantien166
8.1.3 Tierwahl für die Immunisierung166
8.1.4 Immunisierung166
8.1.5 Kultur der Myelomzellen166
8.1.6 Konditionierte Medien und „feeder“-Zellen168
8.1.7 Elektrofusion von Zellen170
8.1.8 Screening tierischer Hybride173
8.2 Hepatocyten174
8.3 Phäochromocytomzellen PC 12178
8.4 Endothelzellen179
8.5 Dreidimensionale Zellkultur184
8.6 Literatur187
9 Die Massenkultur190
9.1 Monolayer-Kulturen für große Zellmengen191
9.1.1 Roller-Kultur192
9.1.2 Wannen-Stapel (multi-tray, cell factory)192
9.1.3 Kapillar-Perfusion (Kapillarreaktor, Dialysator)192
9.1.4 Microcarrier-Kultur (Mikroträger)193
9.2 Suspensionskultur für große Zellmengen196
a197
b c197
9.2.1 Flasche (Celline) mit Silikonmembran für Suspensionskulturen hoher Dichte198
9.3 Literatur198
10 Zellkulturen aus Geweben von Invertebraten und kaltblütigen Vertebraten199
10.1 Invertebraten199
10.1.1 Temperatur199
10.1.2 Atmosphäre199
10.1.3 Medien199
10.1.4 Subkultur200
10.1.5 Suspensionskultur200
10.1.6 Aufbewahrung und Lagerung202
10.2 Kaltblütige Vertebraten203
10.2.1 Fischzellkulturen203
10.3 Literatur204
11 Pflanzenzellkulturen206
11.1 Herstellung von Kulturmedien206
11.2 Kalluskultur aus teilungsfähigem Pflanzengewebe210
11.3 Pflanzenzellkulturen als Suspensionskulturen214
11.4 Isolierung von Einzelzellen und Protoplasten aus Pflanzenzellkulturen215
11.5 Elektrofusion von Pflanzenprotoplasten217
11.6 Fusion von Protoplasten mittels Polyethylenglykol217
11.7 Antherenkultur220
11.8 Embryonenkultur223
11.9 Einfrieren von Pflanzenzellsuspensionen224
11.10 Literatur226
12 Spezielle Methoden der Zellbiologie227
12.1 Versuche zur In-vitro-Toxizität227
12.1.1 Zellkulturmethoden228
12.1.2 Konzentration der applizierten Substanz in vitro und zeitlicher Verlauf der Applikation229
12.1.3 Erholungsperiode230
12.1.4 Endpunkte230
12.2 Methoden zur In-vitro-Toxizitätsprüfung233
12.2.1 Prüfung auf wachstumshemmende Eigenschaften einer Substanz233
12.2.2 Prüfung auf akute Zelltoxizität235
12.2.3 Vitalfärbung zur Testung auf Lebensfähigkeit von Zellen238
12.2.4 MTT-Test zur Messung von Lebensfähigkeit und Wachstum239
12.2.5 Nachweis mutagener Substanzen240
12.3 Transfektion241
12.3.1 Transfektion nach der Calciumphosphatmethode241
12.3.2 Transfektion mittels Elektroporation243
12.3.3 Lipofektion in nicht-adhärenten Zellen245
12.4 Klonierung246
12.4.1 Limited-Dilution-Klonierung246
12.4.2 Klonierung in Weichagar247
12.4.3 Isolierung von adhärenten Zellklonen249
12.5 3H-Thymidineinbau als Proliferationskontrolle250
12.6 Inhibition des Zellwachstums (quantitative Neutralrotmethode)251
12.7 Ermittlung der Anheftungseffizienz („plating efficiency“)252
12.8 Virusvermehrung und Transformation mit Epstein-Barr-Viren ( EBV)254
12.9 Populationsverdopplungszeit256
12.9.1 Populationsverdopplungszeit bei Suspensionskulturen257
12.10 Zellsynchronisation257
12.10.1 Zellsynchronisation durch Abkühlen257
12.10.2 Zellsynchronisation durch Schütteln257
12.10.3 Zellsynchronisation durch Colcemid-Block258
12.10.4 Zellsynchronisation durch Serumentzug259
12.10.5 Zellsynchronisation durch Isoleucinmangel259
12.11 Cytometrie260
12.11.1 Klonierung von Zellen mittels eines FACS262
12.11.2 Bestimmung der Zellzykluszeit einer proliferierenden Population mittels Bromdesoxyuridineinbaus264
12.11.3 Bestimmung von verschiedenen Subpopulationen aus peripheren Humanleukocyten266
12.12 Chromosomenpräparation267
12.13 Literatur269
13 Stammzellen271
13.1 Gewinnung und Kultur hämatopoetischer Stammzellen271
13.2 Embryonaler Stammzell-Test (EST) (Spezies: Maus)277
13.2.1 Grundlegende Verfahren278
13.3 Dezimale geometrische Konzentrationsreihen289
13.4 Löslichkeit der Testchemikalien290
13.5 Literatur291
14 Kleines Zell- und Gewebekulturlexikon292
14.1 Literatur306
15 Anhang307
15.1 Was kann die Ursache von schlechtem Zellwachstum sein?307
15.2 Berechnungen in der Zellkultur308
15.3 Nachschlagewerke und Handbücher der Zell- und Gewebekultur311
15.4 Zeitschriften313
15.5 Literaturdienst313
15.6 Institutionen und Firmen, die Zellkulturkurse durchführen313
15.7 Wissenschaftliche Gesellschaften für Zellkultur314
15.8 Übersichtswerke zur Beschaffung von Geräten, Labormaterial und Reagenzien314
16 Lieferfirmen und Hersteller315
Index323
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