Textprobe: Kapitel 5, Nanoskalige Carbonat-Hohlkugeln aus Mikroemulsionen: Doxorubicin-gefüllte Gadoliniumcarbonat-Hohlkugeln: Die Verwendung von Doxorubicin in der Krebstherapie ist etabliert.[161-162] Das Hauptproblem von wirksamen Cytostatika sind die Nebenwirkungen.[163] Durch den Einsatz von Transportmolekülen oder Hüllen aus Liposomen können die Nebenwirkungen (vgl. Kapitel 5.1.1) minimiert werden. Eine aussichtsreiche Alternative ist es, den Wirkstoff in eine feste anorganische Hülle einzubetten.[119] Verschiedene zuvor genannte Gruppen haben den Ansatz gewählt, Gadoliniumoxid-Hohl-kugeln herzustellen und das Doxorubicin durch Diffusion in diese einzuschließen.[109-110] Diese Hohlkugeln hatten jedoch eine Größe im Bereich von 200-1000 nm, was eine endozytotische Aufnahme verhindert, da Zellen vor allem Partikel von 25 bis 200 nm Größe aufnehmen.[166] In der hier vorliegenden Arbeit wurde die Strategie verfolgt, Doxorubicin-gefüllte Hohlkugeln direkt in einer Mikroemulsion aus den Edukten der Gadoliniumcarbonat-Hohlkugeln und Doxorubicin herzustellen. Dazu wurde Doxorubicin in der polaren Phase der Mikroemulsion gelöst und anschließend wurde analog der Synthese der Gadoliniumcarbonat-Hohlkugeln (vgl. Kapitel 5.1.2) vorgegangen. In Kooperation mit der Gruppe von Prof. Ute Schepers am Institut für Toxikologie und Genetik (KIT) wurden die in vitro Untersuchungen von Dr. Carmen Seidel durchgeführt. Die Wirksamkeit der synthetisierten Doxorubicin-gefüllten Gadoliniumcarbonat-Hohlkugeln auf Krebszellen konnte so in vitro bei gleichzeitig minimaler Toxizität der Hohlkugeln in MTT-Zelltests gezeigt. Der Einschluss von Doxorubicin kann durch UV/Vis-Spektroskopie gezeigt werden. Dabei verschiebt sich die Bande des freien Doxorubicins bei 500 nm deutlich zu 550 nm bei Doxorubicin, das in die Hohlkugeln eingeschlossen ist, da die Absorptionswellenlänge stark pH-Wert-abhängig ist. Auch eine Quantifizierung ist durch vollständiges Auflösen der Hohlkugeln unter Freisetzung des Doxorubicins in Citratpuffer mit einem pH-Wert von 5 gelungen. Anschließend wurde die Doxorubicinkonzentration im Puffer über eine Kalibriergerade mit bekannten Doxorubicinkonzentrationen im gleichen Puffer durch UV/Vis-Spektroskopie quantifiziert. Der Feststoffgehalt der Probe wurde über ein getrocknetes Probenäquivalent gravimetrisch bestimmt. Die Konzentration von eingeschlossenem Doxorubicin beträgt in Dextranpuffer bis zu 0,015 mg/ml bei 0,7 mg/ml Feststoff (Gadoliniumcarbonat). Das Fluoreszenzspektrum von Doxorubicin-gefüllten Gadolinium-carbonat-Hohlkugeln stimmt mit dem von freiem Doxorubicin überein. Das Doxorubicin ist also auch nach der Synthese noch intakt. Eine Zersetzung, die zu einem Ausbleiben der Fluoreszenz geführt hätte, konnte nicht beobachtet werden. In vitro Untersuchungen an HeLa- und HepG2-Zellen: Die intrazelluläre Verteilung und die Biokompatibilität von DXR@Gd2(CO3)3 wurde mit konfokaler Lasermikroskopie (Confocal Laser Scanning Microscopy, CLSM) untersucht. Dabei wurden HeLa-Zellen mit DXR@Gd2(CO3)3 in Dextranpuffer versetzt (0,5 µM Doxorubicin, 6,8 mg/mL Gd2(CO3)3). Nach 4, 8, 24 und 48 h wurden Bilder der Zellkultur aufgenommen (Abbildung 5.28). Die Hohlkugeln schädigen dabei die Zellen innerhalb der ersten 4 h nicht, obwohl eine perinukleare Anreicherung der Partikel (Rotfärbung um den Zellkern) zu erkennen ist. Nach 8 h ist, neben mehr Doxorubicin in der Zelle, auch eine Rotfärbung des Zellkerns erkennbar, was zeigt, dass Doxorubicin in den Zellkern aufgenommen wurde. Im Zellkern hat das Doxorubicin seinen Zielort erreicht und erzeugt ein Anschwellen der HeLa-Zellen sowie nach einiger Zeit eine Nekrose. Das gleiche Verhalten kann auch bei HepG2-Zellen durch Behandlung mit DXR@Gd2(CO3)3 beobachtet werden. Der Einfluss auf die Zellaktivität von kanzerogenen Zellen durch DXR@Gd2(CO3)3 wurde mit einem MTT-Test untersucht. Dabei wurden wieder Zellkulturen von zwei unterschiedliche Zelllinien (HeLa und HepG2) mit verschiedenen Konzentrationen an DXR@Gd2(CO3)3 versetzt und nach 72 h mit unbehandelten Zellkulturen verglichen. Die Konzentrationen sind für DXR@Gd2(CO3)3 bei cDRX=0,25/0,5/1,0 µM und entsprechend cGd2(CO3)3= 6/12/24 mg/L, für wirkstofffreies Gd2(CO3)3 bei cGd2(CO3)3= 6/12/24 mg/L und bei freiem Doxorubicin bei cDRX=0,25/0,5/1,0 µM. Bei Zellen der beiden Zelllinien wurde die Zellüberlebensrate deutlich durch DXR@Gd2(CO3)3 verringert, dabei ist eine Wirksamkeit auch schon bei geringen Konzentrationen zu sehen (LD50-0,3 µM bei HeLa, LD50-1 µM bei HepG2). Die Überlebensrate der Zellen ist besonders bei geringen Konzentrationen (0,25 µM) leicht verringert gegenüber reinem Doxorubicin. Leere Gd2(CO3)3-Hohlkugeln zeigen, außer bei der höchsten Konzentration von 24 µg/mL, nur moderate Toxizität. Insgesamt zeigt DXR@Gd2(CO3)3 eine erhöhte Wirksamkeit bei Krebszellen gegenüber freiem Doxorubicin. Es ist davon auszugehen, dass ein effizienterer Aufnahmeweg in die Zelle durch die Einkapselung in Gd2(CO3)3-Hohlkugeln der Grund dafür ist. Die Gd2(CO3)3-Hohlkugeln zeigen eine moderate Toxizität. Daher kann angenommen werden, dass aus DXR@Gd2(CO3)3 in den Zellkern freigesetztes Doxorubicin Auslöser für die Wirkung ist. Diese Freisetzung wurde über 72 h beobachtet. Ein direkter Vergleich der pharmakologischen Wirksamkeit von freiem Doxorubicin mit DRX@Gd2(CO3)3 kann aus in vitro Experimenten nicht gezogen werden. Die Pharmakokinetik des Wirkstoffs wird beeinflusst durch den säurelabilen Gd2(CO3)3-Container (Kapitel 5.6). Zusätzlich bewirkt der EPR-Effekt eine Anreicherung im Tumorgewebe. Die lokale Verfügbarkeit des Wirkstoffs und damit seine Wirkung und seine Nebenwirkungen werden dadurch wesentlich beeinflusst[21, 167]. Für die Dosisfindung in Mausexperimenten kann von einer Startkonzentration an Doxorubicin zwischen 2,5-10 mg/kg Lebendgewicht der Maus ausgegangen werden.[168] Dies entspricht einer Gadoliniumcarbonat-Hohlkugelkonzentration von 110-470 mg/kg Lebendgewicht der Maus. Eine Vorhersage der Wirkdosis ist nicht möglich, da das Verteilungsvolumen im Organismus stark abhängig von der individuellen Partikelgröße und der Oberflächenbeschaffenheit der Partikel ist,[21] also von Faktoren, die die Membrangängigkeit und die Zirkulationszeit im Blut wesentlich beeinflussen[21, 167]. Die Doxorubicin-gefüllten Gadoliniumcarbonat-Hohlkugeln zeigen in vitro eine erhöhte Toxizität gegenüber kanzerogenen Zellen, während die Toxizität von leeren Gadoliniumcarbonat-Hohlkugeln, außer bei der höchsten gewählten Konzentration, gering ist.