4 Versuche und eigene Durchführung

4.1 Geräteliste

Tab. 4-1 Liste der verwendeten Geräte

4.2 Softwareliste

Tab. 4-2 Liste der verwendeten Software

4.3 Chemikalienliste

Tab. 4-3 Chemikalienliste

4.4 Einstellungen für die Chromatographie

Tab. 4-4 Einstellungen für die Chromatographie („Methode Gerolsteiner“)

4.5 Vorgegebene Regeln

Es gibt keine Norm, die genau beschreibt wie eine Methodenvalidierung durchzuführen ist. Lediglich in der Norm DIN ISO 17025 ist festgelegt:

  - Es müssen die Selektivität, Präzision, Richtigkeit, Robustheit, Wiederfindung sowie die Linearität bewertet

  und dokumentiert werden.

Zur Umsetzung wird keine Aussage gemacht. Nur in DIN 32645 wird festgelegt, wie die Nachweis- Bestimmungs- und die Erfassungsgrenzen zu ermitteln und zu berechnen sind.

4.6 Vorgehen für die Validierung der Nitritbestimmungsmethode

Im Folgenden wird die Validierung der Nitritbestimmungsmethode beschrieben. Bis zur Durchführung dieser Be-stimmungen ab dem 08.10.2013 konnte trotz intensiver Literaturrecherche kein Dokument gefunden werden, welches vorschlägt wie die photometrische Nitritbestimmung durchzuführen ist. Somit wurden die hier vorgestellten Messungen in Eigenregie erarbeitet und durchgeführt.

4.6.1 Präzision

4.6.1.1 Trendtest

Durch den „Neumann-Test“ kann festgestellt werden, ob ein zeitlicher Trend vorliegt. Dies ist sehr wichtig, um qualitativ den Gehalt eines Analyten bestimmen zu können. Hierfür wird ein Standard angesetzt und nach 15, 30, 45, 60, 75, 90, 105, 120, 240, 420 Minuten, sowie nach 22, 27 und 35 Stunden nach Reagenzienzugabe am Photometer vermessen und die Extinktionen werden notiert. Es ist am sinnvollsten diesen Test bei einem höher konzentrierten Standard durchzuführen, da hier Effekte auf den Analyten leichter erfasst werden können. Im vorliegenden Fall wurde ein Standard mit einer Konzentration von etwa 0,055 mg/l untersucht. Wenn sich herausstellt, dass ein Trend vorliegt, deutet dies darauf hin, dass sich der Azofarbstoff mit der Zeit zersetzt, oder die Farbstoffbildung länger als 15 Minuten andauert. Wenn ein Trend vorliegt, muss die minimal, bzw. die maximale Reaktionszeit festgestellt und dokumentiert werden.

I Vorgehen für die Messung eines Trends

Herstellung des Farbreagenzes

In einen 1000 ml Messkolben werden 500 ml Wasser, 40 g Sulfanilamid sowie 100 ml der o-Phosphorsäure gegeben und darin vollständig gelöst. Nachdem dies geschehen ist, werden 2 g N-(1-Naphthyl)-1,2-ethylendiamin-Dihydrochlorid dazu gegeben und mit Wasser bis zur Eichmarke aufgefüllt.

Herstellung des Blindwerts

Ein 100 ml-Kolben wird mit Wasser vollständig gefüllt und mit 2 ml Farbreagenz versetzt. Vor der Verwendung sollte die Farbreagenz mindestens 15 Minuten gelagert werden.

Ansetzen des Standards mit einer Konzentration von 0,055 mg/l

Der Nitrit-Stammlösung werden 10,0 ml entnommen und diese in einen 1 l-Messkolben pipettiert. Anschließend wird bis zur Eichmarke aufgefüllt. 13,75 ml dieser Lösung werden in einen 250 ml-Kolben gegeben und ebenfalls bis zur Eichmarke gefüllt. Anschließend wird der Standard mit 5 ml Farbreagenz versetzt.

Durchführung der Messungen

Nach jeweils 15, 30, 45, 60, 75, 90, 105, 120, 240 und 420 Minuten sowie nach 22, 27 und 35 Stunden wird der Standard am Photometer bei einer Wellenlänge von 540 nm vermessen. Die erhaltenen Extinktionen werden notiert. Die Messungen sollten innerhalb von 4,5 Stunden nach Anschalten des Photometers durchgeführt werden. Bei längeren Wartezeiten ist dieses auszuschalten.

Lagerung der Lösungen

Die Nitritstammlösung, sowie das Farbreagenz sind in braunen Flaschen, bei Lagerung im Kühlschrank, einen Monat lang haltbar.

Abfallentsorgung

Alle Lösungen die N-(1-Naphthyl)-1,2-ethylendiamin-Dihydrochlorid enthalten, müssen in einem speziellen Kanister gesammelt und gesondert entsorgt werden. Sie sind in einen Abfallbehälter zu geben, der ausschließlich für nicht halogenierte, organische Verbindungen vorgesehen ist. Die übrigen Lösungen können in den Ausguss entsorgt werden.

4.6.1.2 Gesamtpräzision

Am sinnvollsten ist es als nächstes Untersuchungen zur Gesamt-, bzw. zur Messpräzision durchzuführen, da die hier erhaltenen Ergebnisse grundlegend für die späteren Bestimmungsmethoden sind. Es ist jedoch nicht möglich ausschließlich die Wiederholpräzision ohne die Messpräzision zu bestimmen, da die Streuung, die vom Photometer verursacht wird, bei späteren Analysen nicht sicher bestimmt werden kann. Die Gesamtpräzision gibt nicht wieder wie stark die Messungen einer einzelnen Lösung schwanken. Sie gibt jedoch Aufschluss darüber, wie genau ein einzelner Standard der Kalibrirgerade gemessen werden kann. Um Aussagen zur Gesamtpräzision machen zu können, werden die Messlösungen mit einer Konzentration von 0,01 mg/l und 0,055 mg/l vermessen. Um diese Bestimmung durchführen zu können, werden für beide Lösungen jeweils fünf Messreihen durchgeführt. Eine Messreihe bedeutet, dass die im Folgenden beschriebenen Verdünnungslösungen jeweils fünfmal unabhängig voneinander anzusetzen sind. Aus diesen werden dann jeweils fünf Standards hergestellt. Diese werden dann am Photometer vermessen und die Extinktionen notiert. Es ergeben sich somit 25 Messungen pro Lösung. Zunächst kann mittels „David-Test“ festgestellt werden, ob die Messwerte normal verteilt sind. Falls man zu dem Ergebnis kommt, dass keine Normalverteilung vorhanden ist, ist es nicht möglich den „F-Test“ oder den „Mittelwert-t-Test“ durchzuführen. Wenn der „F-Test“ und der „Mittelwert-t-Test“ bei Abwesenheit von Ausreißern durchgeführt werden, sollte man als Ergebnis erhalten, dass sich weder der Mittelwert noch die Varianz von Messreihe zu Messreihe stark ändern. Ist dies nicht der Fall, kann die Kalibriergerade nicht genau bestimmt werden. Die Methodenwahl ist zu überdenken. Falls dieser Test zu dem Ergebnis kommt, dass mit hoher Wahrscheinlichkeit keine Normalverteilung vorliegt, kann durch die Ausreißertestes ermittelt werden, ob ein Ausreißer vorhanden ist. Falls es Ausreißer bei mehreren Messreihen gibt, muss davon ausgegangen werden, dass diese Methode nur ungenau durchführbar ist und sie müsste überdacht werden. Anschließend können die Standardabweichung und der Mittelwert der Messreihen bestimmt werden. Es ist zu raten, diesen Test bei einer hochkonzentrierten und bei einer niedrigkonzentrierten Nitritlösung durchzuführen, da hier Aussagen über die Gesamtpräzision bei höher konzentrierten und niedriger konzentrierten Proben gemacht werden können.

I Vorgehen für die Messung der Gesamtpräzision

Herstellung des Farbreagenzes, Herstellung des Blindwerts, Lagerung der Lösungen und Abfallentsorgung

Siehe „4.6.1.1 Vorgehen für die Messung eines Trends“ am Beginn dieses Unterkapitels.

Herstellung der Verdünnungslösung

Aus der Nitritstandardlösung werden 10,0 ml entnommen und in einen 1l Messkolben pipettiert. Dann wird mittels Wasser bis zur Eichmarke aufgefüllt.

Ansetzen des Standards mit einer Konzentration von 0,055 mg/l

5,5 ml der Verdünnungslösung werden in einen 100 ml Kolben pipettiert und bis zur Eichmarke aufgefüllt. Anschließend wird die Probe mit 2,0 ml Farbreagenz versetzt.

Ansetzen des Standards mit einer Konzentration von 0,01 mg/l

1,0 ml wird aus der Verdünnungslösung entnommen und in einen 100ml-Kolben gegeben. Es wird bis zum untersten Miniskus aufgefüllt. Anschließend wird die Probe mit 2,0 ml Farbreagenz versetzt.

Durchführung der Messungen

Die 25 Lösungen werden nach einer Mindestentwicklungszeit von 15 Minuten am Photometer bei einer Wellenlänge von 540 nm gegen den Blindwert vermessen und die einzelnen Wellenlängen werden notiert. Die Messungen sollten innerhalb von 4,5 Stunden nach Anschalten des...